猪腺病毒3型Hexon蛋白多克隆抗体制备与免疫活性鉴定

本研究旨在制备猪腺病毒3型(PADV-3)Hexon蛋白多克隆抗体.试验构建重组原核表达载体pET28a-Hexon,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行Western blotting鉴定,目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫家兔制备Hexon蛋白多克隆抗体.采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度.结果显示,Hexon蛋白原核表达以包涵体形式存在,分子质量约为105 ku;真核细胞表达的Hexon蛋白均定位于HEK293细胞质内,细胞核内无分布;IPMA测定所制备的多克隆抗体滴度为1:1 600,该抗体与体外培养的PADV-3及稳定表达Hexon蛋白的细胞均呈特异性反应.结果表明本试验制备的PADV-3型Hexon蛋白多克隆抗体免疫活性和特异性良好.     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型(BPIV3)的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶(HN)的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段(HNex基因),并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a(+)表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1∶819200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型（BPIV3）的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶（HN）的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段（HNex基因）,并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a（+）表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1：819 200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

1株猪腺病毒3型的分离培养及其fiber蛋白多克隆抗体的制备

本研究旨在对临床1份腹泻病料进行病原的分离培养并探究该病原编码的主要抗原蛋白的生物学特点。采用巢式PCR检测病料猪腺病毒3型（Porcine adenovirus type 3,PADV3）核酸并进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）进行病毒血清学鉴定,PCR扩增fiber基因,将其ORF区克隆至pET-28a（+）载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导重组fiber蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体并测定抗体免疫活性。结果表明,病料为PADV3核酸阳性,感染ST细胞产生典型的"葡萄串"细胞病变效应（CPE）,P5~P11代次中的PADV3核酸稳定,分离的毒株P5代为PADV3型血清学阳性,fiber基因开放阅读框（ORF）为1 296 bp（GenBank登录号：MT774498）,与PADV3毒株的核苷酸相似性最高（86.1%）,与其他毒株相似性均低于40%;原核表达的重组fiber蛋白分子质量为45.2 ku,fiber蛋白多克隆抗体与PADV3感染的细胞呈特异性的细胞核染色。本试验成功分离得到1株PADV3毒株,命名为PADV3-HY1812,所制备的fiber蛋白多克隆抗体具有良好的免疫活性。     

猪NLRP3蛋白的原核表达与多克隆抗体制备

为了获得猪源NLRP3重组蛋白以及针对猪NLRP3蛋白的多克隆抗体,本试验采用原核表达技术对猪源NLRP3蛋白的主要抗原区域进行了截短表达与鉴定,并以重组蛋白为免疫原免疫兔制备兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体。结果显示,经RT-PCR方法扩增到大小为864 bp的NLRP3蛋白的主要抗原区域基因;将目的片段定向克隆至pET-32α原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导获得了大小为50 000的重组蛋白;重组蛋白经纯化后Western blot检测其可与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应;以纯化蛋白为免疫原制备的兔抗NLRP3蛋白多克隆抗体的抗体效价达1∶25 600,Western blot检测其可与NLRP3重组蛋白发生特异性反应。结果表明,获得了具有良好反应活性的NLRP3重组蛋白与多克隆抗体,为研究NLRP3蛋白的结构与功能、NLRP3蛋白与猪炎症性疾病的相互作用机制奠定了基础。     

猪腺病毒3型Protease蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗体制备

试验旨在研究猪腺病毒3型(PADV3)Protease蛋白在大肠杆菌中的表达,并制备该蛋白的多克隆抗体。利用PCR扩增PADV3 Protease基因,构建重组原核表达载体pET28a-PADV3-Protease和真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease,采用双酶切和测序鉴定;将原核表达载体pET28a-PADV3-Protease转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞得到重组原核表达菌株,经IPTG诱导收集蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定,将目的蛋白纯化后与佐剂乳化制备免疫原免疫家兔,制备Protease蛋白多克隆抗体;将真核表达载体pEGFP-PADV3-Protease转染HEK293细胞经G418筛选建立稳定表达EGFP-Protease融合蛋白的细胞系,以该稳定表达细胞系为包被抗原,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)检测抗体的免疫活性与抗体滴度。结果显示,Protease基因开放阅读框(ORF)为615 bp,原核表达系统中Protease蛋白以包涵体形式存在,分子质量大小为23 ku,与真核细胞表达的Protease蛋白分子质量一致,该蛋白在细胞核与细胞质中均有分布,制备的Protease蛋白多克隆抗体能与EGFP-Protease融合蛋白稳定表达真核细胞系发生特异性的反应,与对照细胞无反应。本试验构建了Protease蛋白原核表达菌株和真核表达细胞株,制备的PADV3-Protease蛋白多克隆抗体免疫活性良好,为进一步研究Protease蛋白的生物学功能和PADV3的血清学诊断提供了基础材料。     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒，转化大肠埃希氏菌TOP10，经IPTG诱导，成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDSPAGE分析，在分子质量50．4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDSPAGE分离，并经透析得到了重组融合蛋白，以此融合蛋白免疫家兔，制备并纯化了抗pGH多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测，此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

高致病性禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝...     

猪硒蛋白W的原核表达及IgY多克隆抗体制备

试验旨在优化硒蛋白W （selenoprotein W,SelW）的原核表达系统,并评估SelW的免疫原性和基于IgY抗体检测猪体内SelW的可行性。将获得的猪SelW基因序列密码子进行优化、合成并连接至pET-32a （+）表达载体中,构建原核表达重组质粒pET32a （+）-SelW,转化E.coli BL21（DE3）宿主菌中,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组猪SelW的表达情况,并免疫产蛋鸡制备抗SelW的IgY多克隆抗体,通过间接ELISA检测IgY抗体滴度,采用Western blotting检测IgY识别抗原的特异性。SDS-PAGE结果显示,SelW基因在原核细胞中成功表达,得到了大小约为33 ku的重组蛋白,IPTG最佳诱导浓度及时间分别为0.5 mmol/L和6 h;可溶性分析结果显示,重组蛋白SelW主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测结果显示,免疫后45 d的IgY多克隆抗体的效价可达1：51 200。Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IgY抗体与SelW的亲和力较高。本试验成功构建并优化了SelW蛋白的原核表达系统,提高了SelW蛋白的表达量,获得了具有良好免疫原性的SelW蛋白,制备的IgY抗体能特异性识别猪肌肉组织中的SelW,可用于检测猪组织中SelW的表达、预防硒中毒和缺硒性疾病的监测等,为进一步探究SelW的生物学功能奠定基础。     

猪细小病毒6型ORF2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1₍(348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1₍     

猪NLRP6蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化猪NLRP6蛋白,并制备鼠抗NLRP6多克隆抗体。根据猪NLRP6全基因核苷酸序列（GenBank登录号：XM_003124236.4）设计特异性引物,利用PCR方法从pMD-19T-NLRP6重组载体中扩增NLRP6基因片段,将扩增产物与原核表达载体pET-32a（+）连接,获得重组质粒pET-32a-NLRP6,经抗性筛选阳性菌、双酶切鉴定、PCR及测序分析后,将其转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达及Western blotting鉴定。对获得的重组融合蛋白进行可溶性分析,经变性、镍柱亲和纯化、复性后得到纯化的融合蛋白,将其免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,试验成功克隆大小约为576 bp的NLRP6基因序列,经鉴定重组质粒pET-32a-NLRP6构建正确,通过IPTG诱导获得大小约34 ku的NLRP6重组融合蛋白,Western blotting分析表明其与小鼠抗6×His单克隆抗体呈阳性反应。可溶性分析结果显示,NLRP6重组融合蛋白以包涵体形式存在,约占95%。纯化的NLRP6重组融合蛋白免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,经Western blotting分析显示出特异性反应。本试验成功制备了具有免疫原性的NLRP6蛋白及其鼠源多克隆抗体,为NLRP6蛋白生物学功能及相关疾病致病机制研究提供了基础材料。     

猪丁型冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

【目的】表达与纯化猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)的核衣壳(nucleocapsid, N)蛋白,并制备其多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)。【方法】以PDCoV CHN-HN-1601分离株基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增PDCoV全长的N基因编码序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒pET-28a-PDCoV-N。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导表达12 h。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化N-端和C-端均携带6×His标签的重组N蛋白,并将其免疫新西兰白兔制备抗血清。利用Protein A/G琼脂糖树脂从免疫兔的抗血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对多克隆抗体进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定及抗体效价的间接ELISA测定。【结果】重组PDCoV-N蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为42 ku;上清可溶性N蛋白的...     

猪圆环病毒2b型Cap蛋白多克隆抗体制备及其生物学特性分析

为了使猪圆环病毒2b型(PCV2b)Cap蛋白在猪圆环病毒病等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,本试验将编码PCV2b Cap蛋白的ORF2基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,并构建pET-32a-ORF2重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21受体菌后,通过IPTG诱导表达重组蛋白,将重组蛋白用镍柱进行纯化并免疫大白兔,制备兔抗PCV2b Cap蛋白的多克隆抗体。利用ELISA、Western blotting、间接免疫荧光及病毒交叉反应等试验对制备的多克隆抗体进行生物学特性检测。ELISA检测结果显示,该抗体效价可达到1:2¹⁶;Western blotting检测结果显示,该多克隆抗体可与PCV2b产生特异性的反应条带,说明其具有较好的反应活性;间接免疫荧光试验结果显示,该多克隆抗体能识别感染PK-15细胞中的PCV2b,说明该多克隆抗体具有鉴别诊断PCV2b的能力;病毒交叉试验结果显示,该多克隆抗体能与PCV2b反应,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PRoV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等猪源病毒发生交叉反应,表明该多克隆抗体具有高度特异性。本试验制备的抗PCV2b Cap蛋白多克隆抗体为PCV2b病原特性研究及该病的临床检测奠定基础。     

Preparation of Polyclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2b Cap Protein and Analysis of its Biological Characteristics

In order to build more effective use of porcine circovirus type 2b (PCV2b) Cap protein on the diagnosis and control of diseases like porcine circovirus disease, the ORF2 gene which encoding porcine circovirus type 2b Cap protein was cloned into the prokaryotic expression vector pET-32a (+), constructing a recombinant plasmid pET-32a-ORF2, then the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG to express recombinant protein, the recombinant protein was purified with nickel column.Then polyclonal antibody (PcAb) was prepared by immunization of rabbit with purified protein.ELISA, Western blotting, indirect immunofluorescence assay and the specificity experiments were used to detect the biological characteristics of the polyclonal antibody.The titer of polyclonal antibody was about 1:2¹⁶ detected by ELISA.Western blotting result confirmed that polyclonal antibody could react with PCV2b specially.Indirect immunofluorescence assay showed that polyclonal antibody was able to detect PCV2b in PK-15 cells, this result suggested that the polyclonal antibody had the ability to differential diagnosis of PCV2b.The specificity experiment showed that the polyclonal antibody only reacted with PCV2b, and did not react with PEDV, TGEV, PRRSV, PRoV, PRV and PPV.The polyclonal antibody against PCV2b prepared in this study provided a powerful tool for the study of etiological characteristics and clinic diagnosis of this disease.     

猪IL-2和IL-6的原核表达及多克隆抗体的制备

IL-2和IL-6是机体重要的免疫调节因子,在佐剂的应用方面具有很好的发展前景。论文以pTIL-2和pTIL-6为模板进行PCR扩增得到猪白细胞介素2(pIL-2)和猪白细胞介素6(pIL-6)的全基因序列,通过EcoRⅠ和HindⅢ双酶切及连接反应将目的基因亚克隆到原核表达载体pET30a中构建了融合表达质粒pETIL-2和pETIL-6。将重组质粒分别转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3),37℃在IPTG诱导下高效表达了pIL-2和pIL-6,分子质量分别约为26ku和30ku。将包涵体纯化并复性后免疫家兔,制备的兔抗pIL-2和pIL-6的多克隆抗体经ELISA检测效价在1∶12800以上。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。