绵羊INSL3基因组织表达规律与潜在功能位点分析研究

旨在对绵羊INSL3基因组织表达规律与潜在功能位点进行分析.本研究首先利用RT PCR和实时荧光定量PCR技术对健康、角型正常、1岁的小尾寒羊成年母羊和公羊各3只的INSL3组织表达规律进行研究,随后利用10个品种重测序数据分析INSL3基因区域主成分(PCA)和功能位点.定量结果显示,INSL3基因在卵巢和睾丸中表达...     

威宁绵羊SOCS7和GFAP基因组织表达研究

试验旨在检测细胞因子信号传导抑制蛋白7（suppressor of cytokine signaling 7,SOCS7）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）基因在威宁绵羊不同组织中的表达水平。以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公、母羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR测定威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑6个组织中SOCS7和GFAP基因的相对表达量,从mRNA水平上的探究两个基因之间的表达规律。结果显示,SOCS7基因在威宁绵羊不同组织中均有不同程度的表达,其中脾脏中相对表达量最高,其次是肺脏、肾脏、心脏、肝脏和脑组织,随着威宁绵羊年龄的增大,SOCS7基因在组织中的相对表达量呈现小幅度上升的趋势;GFAP基因在威宁绵羊脑组织中相对表达量最高,其余组织中表达量较低,随着年龄增长总体呈现下降趋势。从性别差异来看,威宁绵羊SOCS7基因相对表达量母羊普遍高于公羊,而GFAP基因则是公羊普遍高于母羊,推测SOCS7基因很有可能负向调控GFAP基因的表达。     

牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP 3基因mRNA表达水平研究

本文采用RT-PCR和荧光定量PCR对牦牛SYCP3基因的组织表达,以及SYCP3基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平进行分析。结果表明,SYCP3基因在牦牛睾丸组织中特异表达,牦牛与犏牛睾丸组织中SYCP3基因的表达水平差异极显著（P〈0．01）。睾丸和附睾组织切片显示,牦牛睾丸组织中可见各级生精细胞,附睾内可见发育良好的精子,而犏牛睾丸组织中无次级精母细胞和更高级生精细胞、附睾内未观测到精子,与人和小鼠SY-CP3基因缺失或表达水平降低出现的表型一致,可以认为SYCP3基因的表达水平可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。     

CAPN3基因在草原红牛不同组织中的表达差异

钙激活中性蛋白酶(CAPN3)参与哺乳动物体内多种重要的生理生化过程,但是有关它的确切生理功能和作用机制研究较少.本研究采用实时荧光定量PCR技术检测CAPN3基因在草原红牛多种组织中的表达水平差异情况.试验结果表明,CAPN3基因在所检测草原红牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、瘤胃和背最长肌8种组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平有所不同.草原红牛脾脏中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织,十二指肠和瘤胃中的CAPN3基因表达量显著高于心脏、肝脏、肺脏、肾脏和背最长肌.本试验为肉牛肉质性状的改良提供了分子遗传学依据,并为深入研究草原红牛体内CAPN3基因的生物学作用及作用机制奠定了基础.     

藏系绵羊IGF-1基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR SYBR GreenI荧光染料法,对藏系绵羊皮肤细胞中IGF-1基因的表达水平进行了相对定量分析,建立了快速检测IGF-1基因表达量的方法。通过该方法检测出了IGF基因在藏系绵羊皮肤细胞中的相对表达量,且表达量有差异。该方法具有灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点。     

GPR54基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位研究

试验旨在研究GPR54(G-protein coupled receptor 54)基因在绵羊不同组织中的表达及其在4~6月龄公羔睾丸组织中的表达特性及定位。本研究采用实时荧光定量PCR法检测各组织GPR54 mRNA表达规律,以及其在不同月龄公羔睾丸中的表达量,运用免疫组化技术对睾丸中GPR54基因进行定位分析。结果显示,GPR54在不同组织中均有不同程度的表达,其中在下丘脑、垂体和睾丸中大量表达;GPR54在4~6月龄绵羊公羔睾丸组织中呈阶段性表达,6月龄表达量显著高于4和5月龄(P<0.05);4月龄时,在精原细胞和极少数的初级精母细胞中检测到较弱的阳性信号;6月龄性成熟时,在睾丸中分裂早期的精子细胞检测到强阳性信号。综上表明,GPR54基因在绵羊不同组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要的作用,并与动物的性成熟及雄性动物精子发生过程有密切的关系。     

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究

本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547~-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。     

CAPN3基因在草原红牛不同组织中的表达差异

钙激活中性蛋白酶（CAPN3）参与哺乳动物体内多种重要的生理生化过程,但是有关它的确切生理功能和作用机制研究较少。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测CAPN3基因在草原红牛多种组织中的表达水平差异情况。试验结果表明,CAPN3基因在所检测草原红牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、瘤胃和背最长肌8种组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平有所不同。草原红牛脾脏中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织,十二指肠和瘤胃中的CAPN3基因表达量显著高于心脏、肝脏、肺脏、肾脏和背最长肌。本试验为肉牛肉质性状的改良提供了分子遗传学依据,并为深入研究草原红牛体内CAPN3基因的生物学作用及作用机制奠定了基础。     

鸡内质网分子伴侣Calnexin基因的生物信息学与组织表达谱分析

为探明鸡内质网分子伴侣钙联结蛋白（Calnexin,CNX）基因特性及蛋白结构和功能,以鸡CNX基因序列为对象,利用生物信息学方法分析了12个物种该分子核苷酸和氨基酸序列的同源性及蛋白的结构和功能,并应用qRTPCR法分析了35日龄海兰白鸡30个组织中CNX mRNA组织表达谱。结果表明,CNX核苷酸序列及氨基酸序列在不同物种中具有一定保守性,该蛋白属于跨膜蛋白,不存在信号肽,酶分类可能属于EC 1.11.1.9,并与糖类特异性结合发挥活性。鸡CNX mRNA在鸡组织中广泛表达,其中在回肠、动脉和腺胃组织中表达量很高,表明CNX是鸡机体内必需蛋白分子,可能在消化系统和心血管系统中发挥更为重要作用。     

THBS3基因在长白猪和通城猪不同组织和不同时期骨骼肌中的表达分析

本研究主要探究血小板反应蛋白3 (thrombospondin-3,THBS3)基因在不同组织及不同时期骨骼肌生长发育过程中的表达规律。利用实时荧光定量PCR方法对THBS3基因在长白猪和通城猪中的组织表达谱,以及在胚胎期(33、45、65、70和90 d)和出生后阶段(0、9、30、60、120和160 d)骨骼肌中的差异表达进行了比较分析。结果表明,THBS3基因广泛表达于长白猪和通城猪各个组织器官,除胃和肠中的表达存在差异外,其在两个猪种中的组织表达谱基本一致,在肺脏中表达量最高。THBS3基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段(P<0.05),但胚胎期骨骼肌中的表达模式在两个猪种间存在一定差异,THBS3基因表达峰值出现在长白猪胚胎期45 d,而其在通城猪中表达峰值出现在胚胎期65 d。结果提示,THBS3基因参与了猪骨骼肌生长发育过程及不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控。     

UCP2基因在小尾寒羊内脏中的差异性表达研究

解偶联蛋白2（UCP2）是一种具有解偶联功能的蛋白质,普遍认为其与脂肪酸代谢、调节ATP生成有关。利用实时荧光定量PCR技术,对不同月龄（6、8、10月龄）小尾寒羊4种内脏（心脏、脾脏、肾脏、瘤胃）组织中UCP2基因的表达量进行了分析。结果表明,UCP2基因在6～10月龄小尾寒羊相同内脏中的表达量差异不显著（P＞0.05）,但在脾脏中的表达量显著（P〈0.05）高于心脏、肾脏和瘤胃,而后三者之间表达量差异不显著（P＞0.05）。试验证明了UCP2基因在小尾寒羊内脏组织中有广泛表达,为UCP2基因可能与免疫相关的观点提供了证据,并且说明在6～10月龄的月龄段内,UCP2基因在小尾寒羊内脏组织中的表达受月龄的影响较小。     

小尾寒羊LHR基因组织表达、多态性及其与产羔性状的关联分析

为了揭示LHR基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPOA)中的表达规律、多态性及其与产羔数的关系,深入了解其对小尾寒羊产羔性状的作用。本研究采用实时荧光定量PCR技术对6只小尾寒羊(FecB++型单、多羔母羊各3只)的生殖及脑组织中LHR基因的表达谱进行分析,同时采用Sequenom MassARRAY~?SNP技术对380只小尾寒羊和380只其他品种绵羊(小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、湖羊和草原型藏羊)LHR基因7个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果显示,LHR基因在小尾寒羊大脑、下丘脑和卵巢中均有表达,其中在卵巢高表达。LHR基因在小尾寒羊多羔群体卵巢、大脑和下丘脑的表达均极显著高于单羔群体(P<0.01)。分型发现LHR基因中,4个SNPs位点的等位基因频率和基因型频率在多羔和单羔品种间差异均达到极显著水平(P<0.01);7个SNPs在大多数绵羊品种中均表现为中度多态(0.250.05);关联分析表明,LHR基因有1个SNP多态性与小尾寒羊各胎产羔数显著相关(P<0.05),2个SNPs多态性与小尾寒羊各胎产羔数呈极显著相关(P<0.01)。本研究发现,LHR基因的3个SNPs位点的多态性与小尾寒羊产羔性状存在一定程度相关,暗示其可能参与小尾寒羊多羔性状调控。     

绵羊肺腺瘤病毒实时荧光PCR检测方法的建立

为建立绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据JSRV的ag基因,选取其保守序列作为检测目的片段,设计并合成相应的引物和TaqMan探针,以自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,经PCR扩增目的基因构建重组质粒pMD-gag,并将其作为阳性标准品,梯度稀释建立标准曲线,得到扩增方程为:y=-0.304x+38.4,扩增效率为100％,线性相关系数为0.999,该方法最低检出量为103拷贝,与其它病原核酸样品无交叉反应,其变异系数在1.374％以内.本研究为快速检测JSRV以及组装检测试剂盒奠定了基础.     

妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜enJSRV及IFN-τ基因表达水平的分析

本研究旨在检测内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒(enJSRV)与干扰素-τ(IFN-τ)在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织的表达以及enJSRV的表达与外周血孕酮水平变化的关系。运用TaqMan实时荧光定量PCR技术和电化学发光法对enJSRV和IFN-τ在妊娠早期蒙古绵羊子宫内膜组织相对表达及孕酮水平进行了测定。实时荧光定量PCR结果显示,enJSRV和IFN-τmRNA在妊娠早期绵羊子宫内膜组织有不同程度的表达。SAS统计学软件分析得出,子宫内膜组织中enJSRV mRNA在妊娠12～14d(交配日为0d)表达较高,2～10、16～30d的表达均低于前者。IFN-τmRNA仅在妊娠12～25d表达,14d达其峰值,30d就不能检出,且差异都极显著(P<0.01)。电化学发光法结果显示,孕酮水平在妊娠2d为0.4ng·mL-1,以后升高,妊娠8～16d维持在8.3ng·mL-1左右,在妊娠19～30d孕酮水平有所下降,30d为2.5ng·mL-1。以上结果提示,子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达与外周血孕酮含量及IFN-τ的变化高度相关,且enJSRV在胎盘的形态发生及生殖生物学方面发挥重要作用。     

马身猪和大白猪不同组织DECR1基因的表达

旨在研究DECR1基因在猪不同组织和品种中mRNA和蛋白水平的表达规律,探讨该基因与脂肪代谢的关系。以山西马身猪与大白猪为试验材料,提取肝脏、心脏、肾脏、脾脏、肺脏、胃、小肠、皮下脂肪和背最长肌组织的总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR技术检测DECR1基因在2个品种各组织中mRNA的相对表达量,采用Western blot技术对各组织中DECR1蛋白进行半定量分析。实时荧光定量PCR结果显示:DECR1基因在各组织中均有表达,组织之间的表达量存在极显著差异(P<0.01),DECR1基因在肝脏、皮下脂肪与心脏中为高丰度表达;在不同品种的皮下脂肪组织中,大白猪DECR1的mRNA表达极显著高于马身猪(P<0.01)。Western blot检测结果显示:DECR1在各组织中均有表达,不同组织的表达量存在极显著差异(P<0.01),在皮下脂肪、肝脏与小肠中高表达;不同品种的皮下脂肪组织中,大白猪DECR1蛋白的表达显著高于马身猪(P<0.05)。猪DECR1基因在不同组织的表达差异可能与脂肪代谢和脂肪沉积有关。     

实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.