绵羊INSL3基因组织表达规律与潜在功能位点分析研究

旨在对绵羊INSL3基因组织表达规律与潜在功能位点进行分析。本研究首先利用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对健康、角型正常、1岁的小尾寒羊成年母羊和公羊各3只的INSL3组织表达规律进行研究,随后利用10个品种重测序数据分析INSL3基因区域主成分(PCA)和功能位点。定量结果显示,INSL3基因在卵巢和睾丸中表达最高,在软角也表达,公羊睾丸表达量极显著高于母羊卵巢组织(P0.01),公羊软角组织表达显著高于母羊(P0.05),结合公母羊角的大小差异,说明该基因可能与角有关。PCA结果显示,该区域一定程度上按角的有无进行品种聚类,进一步说明该区域可能与角有关。功能位点分析发现,4个潜在SNPs位点在有角和无角群体中存在显著性差异分布,其中SNP1处于KDM1A转录因子结合位点上,SNP3位于ESR1结合位点,SNP6存在于终止子区域。同时还发现一个错义突变和同义突变。本研究表明,绵羊INSL3基因可能既与公母羊角的差异有关,也可能与绵羊角的有无有关,并找到多个潜在功能位点,为今后研究其功能机制奠定基础。     

威宁绵羊SOCS7和GFAP基因组织表达研究

试验旨在检测细胞因子信号传导抑制蛋白7（suppressor of cytokine signaling 7,SOCS7）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）基因在威宁绵羊不同组织中的表达水平。以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公、母羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR测定威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑6个组织中SOCS7和GFAP基因的相对表达量,从mRNA水平上的探究两个基因之间的表达规律。结果显示,SOCS7基因在威宁绵羊不同组织中均有不同程度的表达,其中脾脏中相对表达量最高,其次是肺脏、肾脏、心脏、肝脏和脑组织,随着威宁绵羊年龄的增大,SOCS7基因在组织中的相对表达量呈现小幅度上升的趋势;GFAP基因在威宁绵羊脑组织中相对表达量最高,其余组织中表达量较低,随着年龄增长总体呈现下降趋势。从性别差异来看,威宁绵羊SOCS7基因相对表达量母羊普遍高于公羊,而GFAP基因则是公羊普遍高于母羊,推测SOCS7基因很有可能负向调控GFAP基因的表达。     

牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP 3基因mRNA表达水平研究

本文采用RT-PCR和荧光定量PCR对牦牛SYCP3基因的组织表达,以及SYCP3基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平进行分析。结果表明,SYCP3基因在牦牛睾丸组织中特异表达,牦牛与犏牛睾丸组织中SYCP3基因的表达水平差异极显著（P〈0．01）。睾丸和附睾组织切片显示,牦牛睾丸组织中可见各级生精细胞,附睾内可见发育良好的精子,而犏牛睾丸组织中无次级精母细胞和更高级生精细胞、附睾内未观测到精子,与人和小鼠SY-CP3基因缺失或表达水平降低出现的表型一致,可以认为SYCP3基因的表达水平可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。     

CAPN3基因在草原红牛不同组织中的表达差异

钙激活中性蛋白酶(CAPN3)参与哺乳动物体内多种重要的生理生化过程,但是有关它的确切生理功能和作用机制研究较少.本研究采用实时荧光定量PCR技术检测CAPN3基因在草原红牛多种组织中的表达水平差异情况.试验结果表明,CAPN3基因在所检测草原红牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、瘤胃和背最长肌8种组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平有所不同.草原红牛脾脏中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织,十二指肠和瘤胃中的CAPN3基因表达量显著高于心脏、肝脏、肺脏、肾脏和背最长肌.本试验为肉牛肉质性状的改良提供了分子遗传学依据,并为深入研究草原红牛体内CAPN3基因的生物学作用及作用机制奠定了基础.     

藏系绵羊IGF-1基因表达水平的实时荧光定量PCR检测

采用实时荧光定量PCR SYBR GreenI荧光染料法,对藏系绵羊皮肤细胞中IGF-1基因的表达水平进行了相对定量分析,建立了快速检测IGF-1基因表达量的方法。通过该方法检测出了IGF基因在藏系绵羊皮肤细胞中的相对表达量,且表达量有差异。该方法具有灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点。     

GPR54基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位研究

试验旨在研究GPR54(G-protein coupled receptor 54)基因在绵羊不同组织中的表达及其在4~6月龄公羔睾丸组织中的表达特性及定位。本研究采用实时荧光定量PCR法检测各组织GPR54 mRNA表达规律,以及其在不同月龄公羔睾丸中的表达量,运用免疫组化技术对睾丸中GPR54基因进行定位分析。结果显示,GPR54在不同组织中均有不同程度的表达,其中在下丘脑、垂体和睾丸中大量表达;GPR54在4~6月龄绵羊公羔睾丸组织中呈阶段性表达,6月龄表达量显著高于4和5月龄(P<0.05);4月龄时,在精原细胞和极少数的初级精母细胞中检测到较弱的阳性信号;6月龄性成熟时,在睾丸中分裂早期的精子细胞检测到强阳性信号。综上表明,GPR54基因在绵羊不同组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要的作用,并与动物的性成熟及雄性动物精子发生过程有密切的关系。     

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究

本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547~-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。     

CAPN3基因在草原红牛不同组织中的表达差异

钙激活中性蛋白酶（CAPN3）参与哺乳动物体内多种重要的生理生化过程,但是有关它的确切生理功能和作用机制研究较少。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测CAPN3基因在草原红牛多种组织中的表达水平差异情况。试验结果表明,CAPN3基因在所检测草原红牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、瘤胃和背最长肌8种组织中均有表达,且在不同组织中的表达水平有所不同。草原红牛脾脏中的CAPN3基因表达量显著高于其他组织,十二指肠和瘤胃中的CAPN3基因表达量显著高于心脏、肝脏、肺脏、肾脏和背最长肌。本试验为肉牛肉质性状的改良提供了分子遗传学依据,并为深入研究草原红牛体内CAPN3基因的生物学作用及作用机制奠定了基础。     

鸡内质网分子伴侣Calnexin基因的生物信息学与组织表达谱分析

为探明鸡内质网分子伴侣钙联结蛋白（Calnexin,CNX）基因特性及蛋白结构和功能,以鸡CNX基因序列为对象,利用生物信息学方法分析了12个物种该分子核苷酸和氨基酸序列的同源性及蛋白的结构和功能,并应用qRTPCR法分析了35日龄海兰白鸡30个组织中CNX mRNA组织表达谱。结果表明,CNX核苷酸序列及氨基酸序列在不同物种中具有一定保守性,该蛋白属于跨膜蛋白,不存在信号肽,酶分类可能属于EC 1.11.1.9,并与糖类特异性结合发挥活性。鸡CNX mRNA在鸡组织中广泛表达,其中在回肠、动脉和腺胃组织中表达量很高,表明CNX是鸡机体内必需蛋白分子,可能在消化系统和心血管系统中发挥更为重要作用。     

THBS3基因在长白猪和通城猪不同组织和不同时期骨骼肌中的表达分析

本研究主要探究血小板反应蛋白3 (thrombospondin-3,THBS3)基因在不同组织及不同时期骨骼肌生长发育过程中的表达规律。利用实时荧光定量PCR方法对THBS3基因在长白猪和通城猪中的组织表达谱,以及在胚胎期(33、45、65、70和90 d)和出生后阶段(0、9、30、60、120和160 d)骨骼肌中的差异表达进行了比较分析。结果表明,THBS3基因广泛表达于长白猪和通城猪各个组织器官,除胃和肠中的表达存在差异外,其在两个猪种中的组织表达谱基本一致,在肺脏中表达量最高。THBS3基因在长白猪和通城猪胚胎期骨骼肌中的表达水平均显著高于出生后阶段(P<0.05),但胚胎期骨骼肌中的表达模式在两个猪种间存在一定差异,THBS3基因表达峰值出现在长白猪胚胎期45 d,而其在通城猪中表达峰值出现在胚胎期65 d。结果提示,THBS3基因参与了猪骨骼肌生长发育过程及不同类型猪种骨骼肌生长发育异步性的调控。     

小尾寒羊LHR基因组织表达、多态性及其与产羔性状的关联分析

为了揭示LHR基因在小尾寒羊下丘脑-垂体-卵巢轴(hypothalamic-pituitary-ovarian axis,HPOA)中的表达规律、多态性及其与产羔数的关系,深入了解其对小尾寒羊产羔性状的作用。本研究采用实时荧光定量PCR技术对6只小尾寒羊(FecB++型单、多羔母羊各3只)的生殖及脑组织中LHR基因的表达谱进行分析,同时采用Sequenom MassARRAY~?SNP技术对380只小尾寒羊和380只其他品种绵羊(小尾寒羊、滩羊、苏尼特羊、策勒黑羊、湖羊和草原型藏羊)LHR基因7个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms, SNPs)的多态性进行检测,并与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果显示,LHR基因在小尾寒羊大脑、下丘脑和卵巢中均有表达,其中在卵巢高表达。LHR基因在小尾寒羊多羔群体卵巢、大脑和下丘脑的表达均极显著高于单羔群体(P<0.01)。分型发现LHR基因中,4个SNPs位点的等位基因频率和基因型频率在多羔和单羔品种间差异均达到极显著水平(P<0.01);7个SNPs在大多数绵羊品种中均表现为中度多态(0.250.05);关联分析表明,LHR基因有1个SNP多态性与小尾寒羊各胎产羔数显著相关(P<0.05),2个SNPs多态性与小尾寒羊各胎产羔数呈极显著相关(P<0.01)。本研究发现,LHR基因的3个SNPs位点的多态性与小尾寒羊产羔性状存在一定程度相关,暗示其可能参与小尾寒羊多羔性状调控。     

绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用.该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况.绵羊WNT5A基因的CDS区...     

豫西脂尾羊CIDEa基因的克隆、序列分析与组织表达

试验旨在对豫西脂尾羊诱导细胞凋亡DNA片段化因子45样效应因子A （cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effectors A,CIDEa）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在豫西脂尾羊不同组织中的表达。以豫西脂尾羊脂肪组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆豫西脂尾羊CIDEa基因完整CDS区序列,对测序结果进行了相关生物信息学分析,并对CIDEa基因在豫西脂尾羊心脏、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、瘤胃、小肠、背最长肌、皮下和内脏脂肪组织中的表达进行了分析。结果显示,豫西脂尾羊CIDEa基因CDS区序列长660 bp,编码219个氨基酸;豫西脂尾羊与绵羊、水牛、黄牛、藏羚羊、猪和人的CIDEa基因同源性分别为99.1%、96.8%、96.2%、98.8%、85.0%和79.4%。蛋白理化性质分析表明,CIDEa蛋白分子质量为24.38 ku,理论等电点（pI）为9.12,属于碱性蛋白。跨膜结构和信号肽预测分析表明,CIDEa蛋白不含跨膜结构和信号肽。亚细胞定位分析表明,豫西脂尾羊CIDEa蛋白分布在细胞质（47.8%）、线粒体（26.1%）、细胞核（17.4%）、液泡（4.3%）和内质网（4.3%）。蛋白质三级结构预测发现,CIDEa蛋白结构具有2个α-螺旋、4个β-折叠及一些无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果表明,CIDEa基因在豫西脂尾羊脂肪组织（皮下和内脏脂肪组织）中表达量较高,其他组织中表达量从高到低依次为小肠、肝脏、脾脏、瘤胃、心脏、肾脏、肺脏、背最长肌。这些结果可为进一步研究CIDEa基因在肉羊脂质代谢中的功能及羊肉品质调控提供基础资料。     

UCP2基因在小尾寒羊内脏中的差异性表达研究

解偶联蛋白2（UCP2）是一种具有解偶联功能的蛋白质,普遍认为其与脂肪酸代谢、调节ATP生成有关。利用实时荧光定量PCR技术,对不同月龄（6、8、10月龄）小尾寒羊4种内脏（心脏、脾脏、肾脏、瘤胃）组织中UCP2基因的表达量进行了分析。结果表明,UCP2基因在6～10月龄小尾寒羊相同内脏中的表达量差异不显著（P＞0.05）,但在脾脏中的表达量显著（P〈0.05）高于心脏、肾脏和瘤胃,而后三者之间表达量差异不显著（P＞0.05）。试验证明了UCP2基因在小尾寒羊内脏组织中有广泛表达,为UCP2基因可能与免疫相关的观点提供了证据,并且说明在6～10月龄的月龄段内,UCP2基因在小尾寒羊内脏组织中的表达受月龄的影响较小。     

豫西脂尾羊INSIG1基因克隆、序列分析及组织表达

胰岛素诱导基因1（INSIG1）是脂质合成与分解的重要调控基因,为了研究豫西脂尾羊INSIG1基因序列特征及其组织表达规律,试验采用Trizol法提取组织样RNA,RT-PCR扩增后克隆得到INSIG1基因序列并进行分析;采用实时荧光定量PCR法检测INSIG1 mRNA表达情况,并对结果进行比较分析。试验成功克隆了豫西脂尾羊INSIG1基因,其编码区长831 bp,编码276个氨基酸;基因的同源性分析表明,豫西脂尾羊INSIG1基因编码区与绵羊（XM_015095466.2）的亲缘关系相似性达99.64%,编码氨基酸序列的相似性达99.28%;蛋白理化性质分析表明,其分子质量为29.58 ku,理论等电点（pI）为9.07,属于稳定的碱性疏水性蛋白;跨膜结构、信号肽和亚细胞定位分析表明,该蛋白包含5个跨膜结构,没有信号肽,主要分布在细胞质;蛋白质三级结构预测发现,INSIG1蛋白结构含有6个α-螺旋和部分无规则卷曲;实时荧光定量PCR结果表明,INSIG1基因在肝脏中表达量最高,其次为肺脏、小肠和尾脂,肌肉中表达量最低。本研究完善了豫西脂尾羊的数据库,为INSIG1基因的功能及其在肉羊脂肪沉积过程中的作用机制提供了依据。     

滩羊TCHH基因CDS区遗传结构及表达模式分析

试验旨在分析滩羊TCHH基因的遗传结构,并检测该基因在同一月龄不同组织及不同月龄皮肤组织中的表达模式。通过基因同源扩增获得滩羊TCHH基因编码区（CDS）全长,并利用生物信息学技术对序列的同源性、蛋白基本性质及重复序列特征进行分析,同时利用半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR对该基因在皮肤组织中的表达模式进行分析。结果显示,TCHH基因CDS区全长4 425 bp,包含两段重复序列,共编码1 474个氨基酸,滩羊TCHH氨基酸序列在物种内同源性较高,与山羊同源性可达96.3%,物种间的同源性较差,与人和家鼠的同源性分别为48.4%和40.5%。TCHH蛋白分子式为C₈₀₀₆H₁₃₁₈₇N₂₇₈₇O₂₆₆₁S₆,分子质量大小为191.26 ku,理论等电点为5.76,为亲水蛋白,其蛋白不稳定指数为119.37,稳定性较差。TCHH蛋白的氨基酸序列共包含2个保守区,分别为S-100型钙结合域和蛋白激酶结构域,富含α-螺旋,高达89.89%,推测其二级结构为长条棒状分子结构。组织表达谱结果发现,TCHH基因在皮肤组织中特异性表达,其mRNA表达量随着滩羊月龄的增加逐渐降低,与滩羊毛发卷曲性状的生长趋势一致,TCHH基因特殊的结构和表达模式表明该基因在滩羊的毛发卷曲性状中发挥着重要作用。本研究可为滩羊毛发生长的生物学机制研究提供重要的参考依据。     

小尾寒羊ACAA1基因CDS克隆及组织表达谱分析

为探索乙酰辅酶A酰基转移酶1（acetyl-coenzyme A acyltransferase 1,ACAA1）基因的生物学功能,明确该基因在小尾寒羊不同组织中的表达差异,试验采集小尾寒羊心脏、肝脏、胃、十二指肠、小肠、背最长肌、皮下脂肪组织,提取总RNA,根据GenBank中公布的绵羊ACAA1基因序列（登录号：XM_004018227.3）设计引物,利用RT-PCR和分子克隆技术获得小尾寒羊ACAA1基因完整CDS,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测该基因在小尾寒羊不同组织中的表达差异。结果显示,小尾寒羊ACAA1基因CDS长为1 071 bp,编码356个氨基酸;小尾寒羊ACAA1基因氨基酸序列与绵羊、山羊同源性最高,约为100%,与食蟹猴、狒狒和野猪的同源性均为93.0%;系统进化树结果显示,小尾寒羊与绵羊、山羊位于同一分支,亲缘关系较近,与穿山甲、狒狒的亲缘关系较远;各物种间同源性较高,保守性较强。ACAA1蛋白分子质量约为36.92 ku,分子式为C₁₆₀₃H₂₆₃₈N₄₅₈O₅₀₁S₁₈,理论等电点为7.48,半衰期为30 h,消光系数为9 440,稳定系数为40.88,脂溶系数为92.67,亲水性氨基酸残基约占58%,为不稳定的碱性脂溶性亲水蛋白;不存在跨膜结构与信号肽,不是分泌蛋白;主要分布在过氧化物酶体,存在25个磷酸化位点、3个潜在的N-糖基化位点和4个O-糖基化位点。ACAA1蛋白二级结构含有α-螺旋（37.92%）、β-折叠（12.64%）和无规则卷曲（49.44%）,三级结构预测结果与其一致。实时荧光定量PCR结果显示,ACAA1基因在小尾寒羊不同组织中均有表达,其中在肝脏、皮下脂肪、小肠中表达量相对较高。本试验结果为进一步探索小尾寒羊ACAA1基因生物学功能及筛选与肉质性状相关的候选基因提供依据。     

绵羊妊娠期生殖组织Flt-1基因的克隆及其组织表达量的检测

试验从雌性绵羊妊娠期不同阶段的输卵管、子宫内膜、卵泡组织中提取总RNA,根据已发表的绵羊Flt-1基因的cDNA序列设计引物,以β-Actin基因为内参,采用RT-PCR扩增绵羊Flt-1基因,将扩增产物克隆于载体后进行序列分析,并应用Kodak Science 1 D、Bandscan图像分析软件,推断出不同组织中Flt-1基因的表达量。结果表明,从雌性绵羊妊娠期不同阶段生殖道各组织上皮均获得82 bp的Flt-1基因的扩增片段,且Flt-1基因在雌性绵羊生殖道各组织内的表达量不同。说明Flt-1基因对绵羊的妊娠维持起着重要的作用。