基于基因组改组技术的角蛋白酶高产菌株选育研究

【目的】筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,为提高废弃羽毛中角蛋白资源的利用奠定基础。【方法】采用梯度稀释法,以羽毛作为惟一碳氮源对土样中的产角蛋白酶菌株进行筛选,筛选可高效降解羽毛的细菌。通过菌株的形态、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定,并探讨其最适发酵条件。利用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)对目的菌株进行诱变,确定最适诱变条件,并进行原生质体融合,通过基因组改组选育角蛋白酶高产菌株。【结果】分离筛选到1株具有较强羽毛降解能力的菌株ZJT01,该菌落圆形凸出,革兰氏染色呈阳性,酪素水解、硝酸盐利用、柠檬酸利用等生理生化试验均呈阳性。结合菌株16S rDNA同源序列比对分析,初步鉴定其为节杆菌(Arthrobactersp.)。菌株ZJT01产角蛋白酶的最适发酵温度和时间分别为32℃和72h。其DES最适用量为9μL/mL,诱变时间为20min;NTG的最适合质量浓度是0.6mg/mL,处理时间为15min。原生质体制备的最佳条件为:溶菌酶终质量浓度10 mg/mL,酶解温度37℃,酶解0.5h。经过硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)分别诱变处理,获得角蛋白酶活性提高的菌株DES-2和NTG-2;对其进行3轮基因组改组后,筛选到2株角蛋白酶活性比亲本菌株ZJT01提高了5.48倍的重组菌株,且其产酶活性可稳定遗传。【结论】通过基因组改组技术获得了2株角蛋白酶活性大幅提高的菌株F3-5和F3-6,这2株菌对羽毛的降解效果较亲本菌株ZJT01明显提高,具有较好的应用前景。     

高活力锰过氧化物酶菌株的选育及其酶学性质初探

【目的】选育锰过氧化物酶(MnP)活力高的诱变菌株,研究其在秸秆木质素降解中的作用。【方法】利用合适的紫外诱变剂量处理哈茨木霉WRF-2的孢子悬液,通过初筛和复筛,选出1株产锰过氧化物酶能力强的突变菌株,并对突变菌株产生的MnP酶学性质及突变菌株粗酶液对玉米秸秆中木质素的降解效果进行分析。【结果】将哈茨木霉WRF-2孢子悬液在紫外光照射90s后稀释10-4倍,经初筛和复筛获得了1株遗传性状稳定的正突变菌株0202。与出发菌株WRF-2相比,0202菌株的MnP活力提高了169.59%,木质素过氧化物酶(LiP)活力提高了17.98%。酶学性质测定结果表明,0202菌株的MnP底物作用的最适温度为40℃,最适pH为3.0,在pH2.5～3.5以及温度50℃以下MnP活力稳定。Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+对0202菌株的MnP活力有促进作用,Fe2+、Zn2+则对其有抑制作用。用0202发酵后粗酶液处理玉米秸秆48h后,木质素降解率达到了23.64%。【结论】获得了MnP活力高的突变菌株0202,其木质素降解酶系为LiP-MnP型,其对玉米秸秆中木质素的降解效果明显提高。     

诱变选育棉籽粕高效脱毒菌株

以橄榄假丝酵母(Candida oleophila)、克雷克酵母(Kloeckera lindneri)、红酵母(Rhodothece glutinis)为出发菌株,采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)对其进行单一诱变及复合诱变处理,选育出棉酚降解率较高的菌株,并确定单一诱变和复合诱变的最佳诱变条件.结果表明:出发菌株经紫外线和硫酸二乙酯诱变处理后再进行有利突变株的筛选,通过初筛、复筛,获得6株棉酚降解率较高的突变株(GJ-Z-25、GJ-D-25、GJ-Z-25-D-25、GJ-Z-20-D-20、HJ-D-20、HJ-Z-20-D-20),棉酚降解率分别高达90.69%、91.40%、93.78%、89.64%、90.78%和89.56%,比诱变前分别提高了50.00%、51.20%、55.14%、48.29%、26.33%和24.63%;橄榄假丝酵母的复合诱变效果好于单一诱变,最佳诱变条件是紫外线照射25 s,DES处理25 min;红酵母的DES诱变效果好于复合诱变,最佳诱变条件是DES处理20 min.通过本实验获得了高浓度棉酚耐受菌株,棉酚的降解率极显著提高,从而使棉粕营养价值显著提高.     

蹄甲角蛋白酶高产菌株的紫外诱变及酶学性质研究

为了得到蹄甲角蛋白酶高产菌株,本试验对1株产角蛋白酶的黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)N5菌株进行紫外诱变,筛选得到高产突变株U3-22,利用考马斯亮蓝法测定U3-22菌株的角蛋白酶发酵活力达69.9U/mL,比出发菌株的25.4U/mL提高了2.75倍。该角蛋白酶最适反应温度是70℃,最适pH是7.5;K+、Mg2+、Na2SO3对该角蛋白酶有较明显的促进作用,而Mn2+、Zn2+的抑制作用较为明显;突变株U3-22产生的角蛋白酶对蹄甲粉具有很强的分解能力,且具有较好的热稳定性和pH稳定性。结果表明,U3-22产生的角蛋白酶是一种新型的耐高温、耐酸碱角蛋白酶,在动物蹄甲、羽毛等废弃资源的利用中有巨大的应用前景。     

羽毛降解菌DHW-06的分离鉴定及产酶特性研究

【目的】从土壤中分离筛选羽毛降解菌株,检测其产酶条件,研究其所产酶的酶学性质,以丰富角蛋白降解的菌株资源。【方法】从土壤样品中,以牛奶培养基和羽毛培养基筛选羽毛降解菌株,失重法测定羽毛降解率,并对筛选菌株进行形态观察、生理生化检测及16S rRNA序列鉴定。筛选菌株于37 ℃、180 r/min条件下,在以羽毛为唯一碳氮源的培养基中发酵,采用福林酚法测定其角蛋白酶活力,对培养时间（3,6,9,12,15,18,21和24 h）、接种量（体积分数1.5%,3.0%和6.0%）、发酵温度（22,27,32,37和42 ℃）及培养基初始pH（6.0,6.5,7.0,7.5和8.0）进行优化,并研究温度（30,40,50,60,70和80 ℃）、pH（6.0,7.0,8.0,9.0和10.0）、金属离子（K⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Fe³⁺,Zn²⁺,Mn²⁺,Cu²⁺和Ni²⁺）、化学试剂（二硫基苏糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇、异丙醇和二甲基亚砜（DMSO））和不同底物（酪蛋白、角蛋白、牛血清蛋白、牛血红蛋白、天青角蛋白和羽毛粉）对角蛋白酶活力的影响。【结果】从高温处理的土壤样品中筛选到1株羽毛降解菌DHW 06,形态观察、生理生化检测及16S rRNA序列分析初步鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。在培养时间10 h、接种量为体积分数3.0%、发酵温度37 ℃和培养基初始pH 6.5的条件下发酵,最大酶活力达到129.47 U/mL。酶学特性结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为8.0,在30~50 ℃时具有较好的热稳定性。10 mmol/L的Mn²⁺使相对酶活力提高300%,10 mmol/L的Cu²⁺使相对酶活力提高120%;而1 mmol/L的Zn²⁺使相对酶活力丧失12%,1 mmol/L的Fe³⁺使相对酶活力丧失53%。体积分数为10%的β 巯基乙醇使相对酶活力提高1 658.95%,10 mmol/L的DTT使相对酶活力提高577.99%;而10 mmol/L的PMSF使相对酶活力丧失35.88%。该酶具有广泛的底物适应能力,对角蛋白的降解能力最强。【结论】筛选出1株可降解羽毛的菌株DHW-06,明确了其最优的产酶条件和酶学特性。     

高效降解纤维素菌株的选育

[目的]筛选纤维素酶活性高且酶活稳定的纤维素降解菌。[方法]以木霉为出发菌株,用紫外线对其进行诱变处理,通过平板初筛和摇瓶复筛筛选出纤维素酶活力高且酶活稳定的优良突变株,然后分别以滤纸、甘蔗渣、麦秆和稻壳为目标降解物对优良突变株进行底物降解试验。[结果]经紫外线诱变、初筛、复筛,共选育出3株纤维素酶活力高且酶活稳定的优良突变株N1、N2、N3,其中N3的产酶活力最高（348 U/ml）,为出发菌株的2.13倍;N3对各种底物的降解效果均优于出发菌株,分别以滤纸、甘蔗渣、麦秆和稻壳为唯一碳源时,其失重率分别为48.68%、41.28%、26.53%和23.47%。[结论]该研究选育出了高效降解纤维素的菌株N3。     

果胶酶高产菌株的微波-硫酸二乙酯复合诱变选育

以黑曲霉(Aspergillus niger)HY-D7为出发菌株,采用微波、硫酸二乙酯(DES)进行诱变处理以获得果胶酶高产突变菌株。首先使用透明圈法进行初筛,选育出透明圈直径与菌落直径比值有大幅提高的突变株,然后采用固体发酵法进行复筛,最终筛选出1株果胶酶高产突变株HY-Z40,其酶活性达到了2 198 U/g,比出发菌株提高了1.51倍,且遗传性能稳定。     

葡糖醋杆菌高静水压诱变株AFLP体系的建立

【目的】从DNA分子水平研究葡糖醋杆菌及其经高静水压诱变后所得突变株的差异,优化建立了适合葡糖醋杆菌的AFLP技术体系,为细菌纤维素产生菌的高静水压诱变育种提供技术支撑。【方法】以1株从自制醋中分离出来的细菌纤维素产生菌J2及其经高静水压诱变后得到的高产细菌纤维素的突变株M438为材料,对选择性扩增程序的影响因素进行分析,优化建立葡糖醋杆菌的AFLP酶切体系,并对适合葡糖醋杆菌高压诱变前后差异分析的引物组合进行筛选。【结果】酶切模板DNA用量600 ng,酶切时间8 h,过夜连接(反应时间大于10 h),预扩增产物最适稀释倍数为500倍,从24对AFLP选择性扩增引物组合中筛选出了E-T/M-G为适合葡糖醋杆菌高静水压诱变前后差异分析的引物组合。供试2株菌的选择性扩增差异位点只有1处,经测序扩增片段长度为213 bp,提交Genbank比对,其与Gluconacetobacter hanseniiATCC23769 GXY0064基因组序列中24 917~24 723 bp片段相似度为99%。【结论】所建立的AFLP反应体系,适合葡糖醋杆菌J2及其突变株M438的AFLP分析。     

紫外诱变结合链霉素抗性选育小诺霉素高产菌株

以自然筛选的小诺霉素产生菌XDBJ-CF为诱变选育的出发菌株,经最适照射剂量60 s的紫外诱变后,在含20μg/mL链霉素的高氏平板上培养,获得链霉素抗性突变株。突变株摇瓶初筛试验显示,高产突变株的数量大于低产突变株。从正突变株中挑选相对发酵单位130%以上的16株高产突变株进行摇瓶复筛,获得2株小诺霉素高产突变株XDBJ-CF-09-24、XDBJ-CF-09-90,其小诺霉素产量分别比出发菌株提高37.8%和46.3%,C_(2b)组分分别较出发菌株提高10%和20%。     

低温淀粉酶高产菌株的诱变选育

以一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus a myloliquefaciens）A-4为出发菌株,采用紫外线（UV）和亚硝基胍（NTG）诱变,以期筛选出高产低温淀粉酶量诱变菌株;经紫外线诱变、亚硝基胍诱变、紫外线一亚硝基胍复合诱变,所得突变菌株经淀粉酶平板水解圈初筛、再经摇瓶发酵复筛,得高产低温淀粉酶突变株UNA46,其最大产酶量62．13U／mL,是出发菌株A-4的1．96倍;将UNA4-6连续传代6次,低温淀粉酶活性仍可达到第一代的99．7％,试验表明遗传稳定性好。     

高产壳聚糖酶菌株的筛选及诱变育种

目的]研究利用紫外线和硫酸二乙酯（DES）诱变得到产壳聚糖酶活性较高的菌株。[方法]利用以壳聚糖为唯一碳源的选择性培养基,从自然界中筛选得到1株产壳聚糖酶活较高的菌株,对其进行鉴定,并且利用紫外线和DES诱变方法来提高该菌株的产酶能力。[结果]经初步鉴定,大致判定产壳聚糖酶的Y-4菌株为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。经紫外线和DES诱变处理分别得到2株壳聚糖酶活性明显提高的突变株,其酶活分别为8.92和8.12 U/ml,分别是出发菌株Y-4（3.00 U/ml）的3.0和2.7倍。2株突变株经连续传代10次后均具有较高的产酶稳定性。[结论]紫外线诱变较DES诱变效果好。     

淡紫拟青霉角蛋白酶特性初步研究

【目的】对淡紫拟青霉PL-HN-16角蛋白酶的酶学特性进行初步研究。【方法】以鸡毛(黄色和黑色)、鹅毛、猪毛角蛋白为发酵底物,并作为培养基中的惟一氮源,观测发酵液的变化及培养液中的角蛋白酶活性,同时以鹅毛为发酵底物,对淡紫拟青霉角蛋白酶粗酶的最适作用温度和pH进行了初步研究。【结果】PL-HN-16对鸡毛、鹅毛、猪毛均能降解,PL-HN-16角蛋白粗酶最适作用温度为40℃、最适pH为8.0。【结论】在最佳作用温度与pH条件下,PL-HN-16角蛋白酶活性为41U/mL,PL-HN-16对不同发酵底物的降解活性不尽相同。     

角蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及其产酶条件优化

为进一步扩大角蛋白酶高产菌株的来源及提高其产酶能力,采用羽毛粉为惟一碳、氮源平板培养基,对从广西几大原始森林和自然保护区的土壤中得到能够降解羽毛角蛋白的菌株进行了筛选、鉴定及其产酶条件优化。结果表明：共分离出15株可有效降解角蛋白的菌株,其中,银滩3＃、天坑1＃、天坑3＃、天坑4＃、天坑5＃和大明山3＃菌株在羽毛培养基上的菌丝长势较好,且菌丝圈直径超过5 cm,经对3株（银滩3＃、天坑3＃和大明山3＃）在羽毛培养基平板上的菌丝生长圈最大的菌株进行复筛,天坑3＃为对羽毛蛋白降解效果最好的菌株;通过对该菌株形态特征观察,初步认定其为木霉属（Trichoderma）。经优化,碳氮源分别以20 g／L 葡萄糖和40 g／L 蛋白胨为宜,该菌株在此条件下摇瓶震荡培养第4天,以羽毛粉为底物时其角蛋白酶酶活高达34．20 U／mL。     

氯氰菊酯降解菌Y-3的诱变育种与筛选

以从菠菜叶片内分离到对氯氰菊酯降解率较高的菌株Y-3(Corynebacterium vitarumen)为出发菌,进行化学诱变和紫外诱变.结果显示,DES对菌株Y-3的最佳诱变条件为2%60 min、3%40 min和4%20 min,紫外线对对菌株Y-3的最佳诱变条件为5 cm 8 min、10 cm 20 min和15 cm 30 min.通过诱变与筛选,最终获得13株突变株,与野生菌株对比,7株突变株对氯氰菊酯的降解率有明显的提高,其中有3株突变株具有一定的遗传稳定性.     

黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选及鉴定

【目的】筛选能降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的细菌,以期在该毒素的生物脱毒中得到应用。【方法】以香豆素为惟一碳源和能源进行AFB1降解菌株的初筛,之后将初筛的10株菌分别降解浓度为100μg•kg-1的AFB1。【结果】筛选出的NMO-3菌株降解AFB1能力达85.7%,显著高于其它菌株（P＜0.01）。从形态、生理生化反应以及16S rDNA序列比对等方面分析,最终确定NMO-3菌株为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。【结论】利用香豆素作为惟一碳源和能源筛选出了黄曲霉毒素降解菌株,后期试验证明活菌制剂在2.56×1010CFU/ml剂量以下不会引起急性毒性反应,用65%硫酸铵提取的蛋白（酶）具有AFB1降解能力。     

链霉菌BM10菌株的诱变选育

链霉菌BM10菌株是中国热带农业科学院热带生物技术研究所从海南原始森林土壤中分离得到的一株生防菌,其代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌具有较强抑制作用。以此菌株为出发菌株,进行紫外(UV)、微波(MW)、亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES)和氯化锂(LiCl)诱变处理,采用平板对峙初筛和摇瓶培养复筛,均能筛选到拮抗活性明显提高的突变菌株,尤以亚硝基胍诱变效果最好,其次是紫外线诱变、硫酸二乙酯诱变、氯化锂诱变和微波诱变。经传代实验,高效突变株N1-45-9对香蕉枯萎镰刀菌的拮抗效果比原始菌株提高69.4%,且遗传稳定性良好。     

高效秸秆降解菌株的分离与选育

为了选育高效降解玉米秸秆的菌株,首先用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基结合滤纸条无机盐培养基,对从样品中分离的菌株进行初筛,再以玉米秸秆培养基复筛并进行发酵产酶试验,测定CMC-Na酶活和FPA酶活,最后对目的菌进行紫外诱变。通过筛选得到降解效果较好的2株真菌PJ-2、PJ-4和1株放线菌GJ-1。紫外诱变后获得正向突变菌3株,分别为PJ-2的突变菌UV-1-1,PJ-4的突变菌UV-2-2和UV-2-4,这3株突变株的CMC-Na酶活力相对原菌株分别提高45%、20%和10%以上,菌株降解秸秆能力也显著提高。     

产谷氨酰胺转胺酶菌株的高通量筛选

【目的】用醋酸纤维素膜和96孔板2种方法高通量筛选高产谷氨酰胺转胺酶(MTG)的茂原轮枝链霉菌菌株。【方法】利用紫外诱变获得茂原轮枝链霉菌突变体库后,分别利用醋酸纤维素膜和96孔板2种方法高通量初筛产MTG菌株,然后依次用试管和摇瓶发酵法复筛,并对96孔板高通量筛选方法的条件进行了优化。【结果】利用醋酸纤维素膜显色法从3 000株紫外诱变的菌株中筛选出1株高产MTG茂原轮枝链霉菌,其MTG活性为4.9U/mL,较出发株(MTG活性2.7U/mL)提高了80%。优化的96孔板高通量筛选方法为:直径为3mm左右的单菌落接种至150μL发酵培养基中,30℃200r/min培养72h;利用该法从3 415株紫外诱变的菌株中筛选获得了2株MTG高产株,其MTG活性为5.4U/mL,较出发株(MTG活性为3.0U/mL)提高了80%。【结论】利用基于醋酸纤维素膜和96孔板的2种高通量筛选方法分别筛选到1株和2株高产MTG的茂原轮枝链霉菌;相较传统的选育方法,这2种高通量筛选方法都大大降低了经济成本,提高了筛选效率,缩短了选育周期。     

具有苹果枝条降解及生防能力真菌的筛选与鉴定

【目的】筛选具有苹果废弃枝条纤维素降解及生防能力的真菌菌株,为果园废弃枝条的资源化利用奠定基础。【方法】以羧甲基刚果红培养基初筛、粉碎枝条为菌源复筛、纤维素酶活性测定、枝条发酵培养和离体对峙试验,从废弃枯枝样品中筛选具有苹果枝条降解能力和腐烂病生防能力的真菌菌株;结合形态特征和基因序列的同源性分析鉴定,明确菌株的分类地位。【结果】筛选出4株具有产纤维素酶的真菌菌株,分别命名为MM1、MX-1、MX-2和Z-2-1。MX-2的滤纸酶活性高达（12.96±0.02）U/mL,MM1、Z-2-1、MX-1的滤纸酶活性分别为（10.08±0.01）、（10.47±0.18）、（6.16±0.15）U/mL;MX-2枝条纤维素降解率高达（21.27±0.56）%,Z-2-1和MM1的枝条纤维素降解率分别为（14.65±0.35）%和（12.73±0.91）%,MX-1最低。对峙试验表明,Z-2-1可与腐烂病菌形成抑菌带。经鉴定,MM1、MX-1、MX-2和Z-2-1分别为深绿木霉、雅致放射毛霉、黑曲霉和穗状弯孢菌。【结论】获得的4株真菌均对苹果废弃枝条具有降解作用,其中MX-2的降解效果最好,Z...     

空间搭载长双歧杆菌BBMN68耐氧株筛选及其耐酸耐胆盐特性

【目的】通过航空诱变技术筛选耐氧性能良好且耐酸、耐胆盐的长双岐杆菌菌株.【方法】将实验室分离自百岁老人肠道的长双歧杆菌BBMN68搭载于"神舟十一号"飞船,进行航空诱变,将筛选的菌株采用16S rDNA测序,测定600nm处好氧/厌氧的OD值,比较野生株和突变株耐氧能力的差异,并用接种法对野生株和突变株的耐酸和耐盐特性进行了比较.【结果】与野生株耐氧能力(好氧D_(600nm)/厌氧D_(600nm)值为0.70)相比,突变株耐氧能力显著提高(好氧D_(600nm)/厌氧D_(600nm)值为0.87).突变株在pH6.5的MRSC培养基中24 h的生长情况与野生株并无差异,且透射电镜显示的结果也无明显差异.同时,经过航天诱变的菌株耐酸能力和耐胆盐能力与野生株比较也没有下降.【结论】航天诱变可以有效提高长双歧杆菌BBMN68耐氧能力,且不会影响其生长性能和耐酸性与耐胆盐能力.