犬α-干扰素蛋白在不同表达载体中的生物学活性比较

根据GenBank中公布的犬α-干扰素（CaIFN-α）基因核酸序列,去掉信号肽后设计并合成1对引物,引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。以提取的犬肝脏DNA为模板,利用PCR技术扩增CaIFN-α基因,并分别克隆至表达载体pBV220、pET-32a（His标签）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）原核表达系统。重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定。纯化目的蛋白,并采用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。试验结果表明,与pBV220载体连接的目的基因表达的蛋白活性较低,而与pET-32a（His标签）连接的目的基因表达的蛋白活性较高,达2.56×10⁶ U/mL。通过分析不同载体对IFN-α的表达情况,为生产高活性的IFN奠定基础。     

重组犬α6干扰素的酵母表达及其抗病毒活性评价

试验旨在构建犬α6干扰素毕赤酵母表达系统,并对其进行优化和筛选,以期获得高活性的重组犬α6干扰素(CaIFN-α6)。根据CaIFN-α6基因序列,按毕赤酵母菌密码子偏好性对CaIFN-α6全基因序列进行优化与合成,用XhoⅠ和NotⅠ双酶切将其连接至载体pPICZαA中,构建pPICZαA-CaIFN-α6重组表达质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。提取质粒pPICZαA-CaIFN-α6并线性化,电转入酵母感受态细胞X33中制备重组菌。采用甲醇进行诱导表达,收集上清,超滤浓缩,最终获得纯化的重组CaIFN-α6。利用BCA法测得纯化后的CaIFN-α6蛋白浓度为1.5 mg/mL,Western blotting分析表明CaIFN-α6蛋白具有良好的反应原性,SDS-PAGE显示其纯度约在95%以上,MDCK/VSV法检测其效价为2.37×10~7 IU/mL,比活性为1.58×10~7 IU/mg。结果表明犬α6干扰素在毕赤酵母pPICZαA表达载体系统中成功表达,且具有较高的生物活性,为后期的犬病毒病的临床预防与治疗提供了良好的支撑。     

鸡β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性测定

为研究鸡β干扰素（chicken interferon-β,ChIFNβ）蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗病毒活性,将克隆的ChIFNβ基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNβ。将鉴定正确的质粒pPIC-ChIFNβ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1.0%甲醇连续诱导4 d,表达产物利用SDS-PAGE电泳、细胞病变抑制法等进行分析。ChIFNβ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为17 ku。表达产物以细胞病变抑制法检测其活性,效价为10^7.5 U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白可提供70%的免疫保护。表达的ChIFNβ蛋白具有较好的抗病毒活性,本研究可为ChIFNβ的应用提供重要参考。     

犬α-干扰素原核表达及其抗病毒活性检测

干扰素(interferon,IFN)是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子,具有阻止病毒繁殖、调节机体免疫反应的生物学功能,是当今应用前景最为广阔的重要生物制剂之一[1-2]。干扰素按其细胞来源可分为α、β及γ3种类型,其中α-干扰素(IFN-α)是由能在脊椎动物各种类型的细胞中增殖     

重组犬γ干扰素的分泌表达及抗病毒活性鉴定

为了研究犬γ干扰素在抗病毒方面的应用价值,依据乳酸菌密码子的偏好性和原核表达载体p AMJ399的特点,在不改变编码蛋白的基础上,将原有的犬γ干扰素序列重新优化,构建重组乳酸乳球菌p AMJ399-Ca IFNγ/PSM565,获得了分泌表达的犬γ干扰素蛋白,将培养p AMJ399-Ca IFNγ/PSM565的培养上清液进行5倍浓缩后与MDCK细胞进行作用24 h后,接种VSV病毒,通过观察病变、MTT法检测活细胞数及荧光定量PCR检测方法,均证实该蛋白能够抑制VSV的复制,具有明显的抗病毒活性。为进一步研究犬γ干扰素在临床上的抗病毒应用和作为细胞因子佐剂的研究奠定了基础。     

重组牛α干扰素的分泌表达及抗病毒活性分析

本研究旨在利用乳酸乳球菌构建牛α干扰素（BoIFN-α）的分泌表达系统并分析其抗病毒活性。根据乳酸乳球菌MG1363密码子使用的偏好性,对BoIFN-α基因进行优化合成。将目的基因和乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399分别进行SalⅠ和BglⅡ双酶切,将胶回收产物进行连接后,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,提取阳性质粒电转化乳酸乳球菌感受态细胞,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达蛋白进行分析和鉴定,同时将重组乳酸乳球菌培养28 h后取上清用PEG20000浓缩10倍左右,进行体外抗病毒试验。结果显示,试验成功构建了重组乳酸乳球菌pAMJ399-BoIFN-α/MG1363,重组菌上清和沉淀均出现约20 ku的目的条带,表明重组蛋白以分泌的形式同时存在于培养液的上清和沉淀中。浓缩后的重组BoIFN-α（rBoIFN-α）上清与水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）同时作用,用MDBK/VSV系统以微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-α的效价为1.02×10⁶ U/L;通过Alamer Blue法分析可知,加入rBoIFN-α后对细胞的活性影响较小;间接免疫荧光试验可见加入rBoIFN-α后细胞无绿色荧光,说明rBoIFN-α有良好的抗病毒效果;实时荧光定量PCR结果进一步证实rBoIFN-α具有一定的抗病毒效果。本试验构建了能分泌表达rBoIFN-α的乳酸乳球菌,通过一系列的体外抗病毒试验证明rBoIFN-α具有良好的抗病毒活性,试验结果为rBoIFN-α作为抗病毒药物、免疫增强剂的开发、肽类用药及临床应用提供新途径。     

犬IFN-α优化基因的真核表达及抗病毒活性的研究

本研究根据酵母系统密码子的偏嗜性,对成熟蛋白基因核苷酸序列进行密码子偏嗜性改造,利用毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC来表达犬IFN-α成熟蛋白基因。并采用非洲绿猴肾细胞(Vero) -水疱性口炎病毒(VSV)系统以细胞病变抑制法为基础来测定重组犬α干扰素的效价,同样方法测定了表达产物对PRV和CDV的抑制作用。本试验实现了犬α干扰素在酵母中的高表达,表达量高达58 mg/L,SDS-PAGE检测大小约为24 ku,比预测分子质量大,推测发生了糖基化。表达产物具有较强的种属特异性,在Vero细胞上对PRV具有较高的抗病毒活性,达到了3.6×10⁷ U/L,对CDV也有很好的抑制作用。本研究为犬IFN-α以后的临床应用研究奠定基础。     

犬α干扰素的原核表达及活性检测

本研究合成了编码CaIFN-α蛋白的基因片段,分别与温度诱导表达载体pBV220和化学诱导表达载体pET20b连接,构建了pBV220-CaIFN-α和pET20b-CaIFN-α重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21,通过温度诱导和IPTG诱导表达,CaIFN-α蛋白表达量分别为25%和20%。对比两方法诱导表达结果,确定最佳诱导方法为温度诱导。表达菌经超声破碎、变性、复性、疏水层析和分子筛层析后,得纯化的CaIFN-α蛋白,纯度约为96%。利用MDCK(犬肾细胞)-VSV(水疱性口炎病毒)体系,测定纯化后CaIFN-α蛋白的生物学比活性为3×107U/mg。     

猪Ⅰ型干扰素融合表达及其抗病毒活性检测

采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术将猪I型干扰素PoIFN-α和PoIFN-β成熟肽基因进行连接,构建表达载体pET30a-PoIFN-α/β进行融合表达,利用细胞病变抑制试验检测融合干扰素rPoIFN-α/β抗病毒活性,并与非融合干扰素rPoIFN-α和rPoIFN-β进行比较分析。结果表明,在PK-15细胞上,融合干扰素rPoIFN-α/β表现出较强的抗病毒活性,其对VSV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PASTV、PEDV和TGEV的抗病毒活性明显高于非融合干扰素,体现了一定的叠加效应,可以用于猪病毒性疾病的防治。     

在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬0干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein (SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒.重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白.重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础.     

犬干扰素α制备工艺的优化

根据Genbank的犬干扰素仪序列,经密码子优化后,设计并合成了编码CalFN-仪蛋白的基因片段。CaIFN-0l基因与pBV220温度诱导表达载体连接,转化大肠杆菌BL21。经培养、升温诱导表达,目的蛋白以包涵体的形式存在,蛋白分子量约为18000,蛋白表达量为25％。菌体经超声破碎、变性、复性后,目的蛋白纯度为69％,收率为28％;疏水层析后,目的蛋白纯度87％,收率为81％;分子筛层析后,目的蛋白纯度为96％,收率为90％。纯化的CalFN-o蛋白的生物学比活性为3×10’IU／mg,内毒素≤10EU／mg,符合兽用药要求。此制备工艺总产率高达20％、重现性好,适用于大规模生产。     

重组猪α-干扰素喷干粉剂的制备及其效果评价

为制备一种高活性、低价格重组猪α-干扰素（PoIFN-α）,采用喷雾干燥技术制备出重组猪α-干扰素（rPoIFN-α）喷干粉剂,并通过对rPoIFN-α喷干粉剂的稳定性,安全性,治疗效果等质量标准进行综合评价。结果显示,本试验制备的重组猪α-干扰素喷干粉剂质量稳定性,有效期暂定为两年;除10倍剂量rPoIFN-α喷干粉剂导致猪肝脏轻微脂肪样病变,其余各较低剂量rPoIFN-α喷干粉剂对猪无毒副作用;人工感染和临床应用试验表明rPoIFN-α喷干粉剂对猪腹泻具有显著的治疗效果。以上试验结果为PoIFN-α喷干粉剂的工程化生产及其在养猪业中的应用打下了基础。     

兔干扰素研究进展

干扰素因其抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫活性及免疫调节作用被广泛关注和研究.兔干扰素的研究与其他动物干扰素的研究相比较为落后.文章综述了兔干扰素的分类、原核表达、真核表达、抗病毒活性的研究进展,并结合兔干扰素的相关研究进展进行了展望.     

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID₅₀及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基...     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET一32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用west,ern blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性.结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同...     

水貂源犬瘟热病毒F基因真核表达载体的构建及鉴定

通过T-A克隆技术,成功地构建了克隆载体PMD-18T-CDVF,用KpnI和BamHI双酶切克隆质粒PMD-18T-CDVF后,回收F基因,并将此基因定向克隆至相同双酶切回收后的pcDNA3.1真核表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-CDVF。经DNA测序、限制性内切酶分析和PCR鉴定,证实成功地构建了重组质粒,从而为研究犬瘟热新型疫苗奠定了基础。