5种常见犬腹泻病毒基因芯片检测方法的建立

为建立一种简便、快速、高效的可同时区分犬腺病毒1型(canine adenovirus type 1,CAV-1)、犬腺病毒2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)、犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)、犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) 5种常见犬腹泻病毒的基因芯片诊断方法,本研究以CAV-1、CAV-2、CCV、CDV、CPV 5种犬腹泻病毒为靶病毒,根据NCBI上收录的病毒基因序列在其保守区域内设计引物,在此基础上根据变异区域设计针对每种病毒的探针2～3条,优化检测体系的各反应条件,确定该检测方法的特异性与敏感性,建立可同时区分5种病毒的基因芯片检测方法。结果显示,建立的基因芯片检测方法可同时检测以上述5种犬腹泻病毒,其中PCR的退火温度为55℃、延伸时间为1 min 15 s;探针与PCR产物的杂交温度40℃、杂交时间2.5 h时,该方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒标准品的检测限分别为0.2 fg/μL、2 fg/μL、2 fg/μL、20 pg/μL和0.02 fg/μL,具有较高的灵敏性;同时对犬副流感病毒进行特异性试验,发现无阳性信号出现,具有较强的特异性;对14份临床腹泻样品检测结果显示,基因芯片方法对CAV-1、CAV-2、CCV、CDV和CPV 5种病毒的阳性检出率分别为28.57%、50.00%、64.28%、14.28%和85.71%,并且基因芯片检测方法的敏感性较PCR要高10～100倍。以上结果表明,本研究建立的基因芯片检测方法具有特异、敏感等特点,对临床中犬类混合感染病毒检测具有一定的诊断意义。     

皮毛中5种病毒基因芯片检测方法的研究

根据GenBank上蓝舌病病毒(BTV)、O型口蹄疫病毒(FMDV)、山羊痘病毒(GPV)、绵羊痘病毒(SPPV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)等5种病毒的特异性保守序列,分别设计多重荧光标记引物和相应寡核苷酸探针.使用芯片点样液稀释各探针至终浓度30μmol/L,点样制备11×11阵列芯片.核酸杂交后,建立并优化基因芯片检测方法.结果显示,使用470 mL/L甲酰胺杂交液,42℃摇转杂交4h为最佳基因芯片杂交条件.建立的基因芯片检测方法与伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)等无交叉反应,检测敏感性可达20拷贝病毒核酸.制备的基因芯片稳定,保存6个月可用.对151份临床样品进行基因芯片和商业化PCR试剂盒平行检测,两者的符合率为100％.     

可视化猪瘟病毒基因芯片鉴别检测方法的建立

为建立一种能够快速鉴别猪瘟病毒野毒和疫苗弱毒株的临床检测方法,本实验针对猪瘟病毒野毒株及疫苗弱毒株分别设计了特异性鉴别引物及探针,利用RT-PCR方法特异性扩增目的基因后进行芯片杂交反应并显色,直观判定检测结果,经反应条件优化建立了一种鉴别检测猪瘟病毒的基因芯片方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行了试验.结果显...     

三种犬呼吸道常见病毒多重PCR检测方法建立

为建立犬呼吸道冠状病毒(Canine respiratory coronavirus,CRCoV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)3种病毒的多重PCR方法,根据GenBank中CRCoV、CPV和CDV的基因序列,进行BLAST同源性分析,找出保守序列,并根据保守序列对每个病毒设计引物,建立扩增3种病毒的多重PCR方法,并通过已建立的方法对收集的呼吸道病犬病料进行检测。结果表明,所建立的三重PCR体系组成为2×Taq Mix 12.5μL,3对上、下游引物各0.6μL,混合模板1μL,ddH₂O 7.9μL;扩增程序为94℃5 min;94℃30 s,54℃1 min,72℃24 s,共35个循环;72℃8 min。该方法具有较高的灵敏性和特异性。临床验证实验表明,本实验所建立的多重PCR方法可用于临床诊断。     

猪流感病毒基因芯片检测技术的研究

根据猪流感病毒(SIV)的M基因序列设计了1对特异性引物M1/M2,扩增出大小为229 bp的目的片段.针对这个基因片段,再设计合成4条寡核苷酸探针,其中反向引物的5'端用荧光素Cy3标记.以荧光标记不对称PCR技术为基础,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测,建立SIV的基因芯片检测方法.利用该方法对39份猪组织样品进行检测,与RT-PCR检测方法相比,本方法具有良好的特异性和敏感性.试验结果表明,用该方法快速检测组织中SIV是可行的,对该病的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义.     

犬常见腹泻症及其疗法

腹泻是种综合性症状,它可由多种因素引起,常发生在许多疾病的经过之中。犬,尤其是幼龄犬的腹泻症,其发生率和死亡率均很高,是常见的病之一。 以腹泻为主症的常见犬病可分为消化性疾病、细菌性疾病和病毒性疾病。 一、消化性疾病 1.消化不良性腹泻 (1)病性:胃肠消化功能降低,肠蠕动加快。 (2)病因:由于采食过量,使胃部扩胀,胃肠消     

五种重要犬病毒微流控芯片检测方法的建立及应用

狂犬病毒、伪狂犬病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒是引起犬科动物重要传染病的5种病毒,严重威胁着犬科动物的健康,是出入境犬科动物重点筛查的致病因子。为提升口岸进出境犬科动物检疫工作效率,建立了上述5种病毒微流控芯片检测方法。在建立5种病毒环等温扩增检测技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)的基础上,将这些LAMP检测体系固化在同一块塑料芯片上,制备了同步高通量快速检测微流控芯片,并将其应用于临床检测。结果显示:微流控芯片检测方法具有良好的特异性,含有目的基因的阳性样本仅在芯片上相应病毒反应槽出现显著扩增,而其他病毒反应槽未出现扩增,彼此无交叉反应;微流控芯片的敏感性与LAMP方法一致;通过检测不同时期收集的感染犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬冠状病毒临床样本,证实建立的微流控芯片检测方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有核酸检测方法相比,微流控芯片可以在受试核酸上样40 min内完成上述5种犬病毒的快速筛查,从而满足进出境犬科动物快速检疫的需求。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒基因芯片检测技术的建立与优化

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核衣壳蛋白编码基因序列设计了一对特异性引物P1／P2。扩增出大小为294bp的目的片段；再针对这个基因片段。设计合成4条寡核苷酸探针。其中反向引物的5’端用荧光素Cy3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础。通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测。建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测。与RT—PCR检测方法相比。本方法具有良好的特异性和敏感性。试验结果表明用该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的，对该病的进行快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。     

犬腹泻的诊治

近年来随着人们防疫意识的提高和传染病疫苗注射，犬瘟热、犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬冠状病毒等传染病的发病率不是很高，而普通的细菌感染胃肠道引发的腹泻却经常发生，如果患犬得不到及时救治也可导致死亡。     

犬腹泻的临床诊治

犬腹泻是常见的一种临床症状 ,发病原因较多不易预防。一般将具有腹泻症状的疾病统称为腹泻病 ,该病使幼犬生长发育受阻 ,同时并发营养不良 ,二者互为恶性循环 ,严重时可导致死亡。虽然用于治疗犬腹泻的的药物较多 ,如庆大霉素、磺胺脒、氟哌酸等。但临床上因病因很多 ,诸如大肠杆菌等引起的细菌性肠炎 ,细小病毒引起的病毒性肠炎以及温度变化、食物腐败等多种因素诱发的腹泻等 ,单纯使用抗生素治疗难以起到理想的治疗作用 ,而且随着抗生素的长期大量使用 ,某些致病菌的耐药性越来越强。因此 ,需要根据不同的临床表现 ,采用综合治疗措施 ,标…     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒（PEDV）的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示：该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）及传染型胃肠炎病毒（TGEV）等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×10¹拷贝·μL^-1,比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%～99.1%;氨基酸的相似性为94.6%～98.7%。结果表明：本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。     

检测牛5种腹泻病毒的多重RT-PCR方法的建立及应用

牛A群轮状病毒(BRVA)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛诺瓦病毒(BNoV)和牛纽布病毒(BNeV)是引起犊牛腹泻的常见病毒,且临床上多存在混合感染的情况.本试验的目的 是建立可以同时检测上述5种病毒的多重PCR方法.通过设计引物,优化反应体系和条件,成功建立了可同时检测BRVA、BCoV、...     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究以纯化的PEDV 为包被抗原,通过优化 ELISA 反应条件,建立了间接 ELISA 抗体检测方法,其反应条件为：抗原最佳包被浓度为 20 μg/mL,血清标准品最佳稀释度为 1：500,包被时间为4℃过夜,5%小牛血清37℃封闭1 h,二抗 1：10 000稀释,37℃作用1 h,抗体临界值为 D_{450 nm}≥ 0.289判为阳性,D_{450 nm}≤ 0.236判为阴性,介于二者之间为可疑。检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和口蹄疫病毒标准血清抗体均为阴性,重复试验变异系数均小于10%,对江苏、江西、福建、广东地区74份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达84%,表明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于 PEDV 抗体检测和流行病学调查。     

Establishment of Indirect ELISA Detection Method for Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D_{450 nm}≥0.289,as negative when D_{450 nm}≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future.     

基因芯片检测鱼类病毒的方法建立与优化

本研究建立并优化了一种基因芯片检测方法,可以同步检测7种重要的海水养殖鱼类病毒（淋巴囊肿病毒、细胞肿大病毒属虹彩病毒、赤点石斑鱼神经坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、传染性胰脏坏死病毒、病毒性出血败血症病毒、传染性鲑贫血病毒）。该基因芯片包含10条病毒特异性的寡核苷酸探针（25~30 mer）分别与病毒的CP、N、VP5、G、NS、MA等基因位点互补。将各病毒基因探针以50% DMSO稀释至20μmol/L,使用PersonalArrayer 16个人点样仪在醛基修饰玻片上点样,然后与Cy3标记的扩增产物在47℃条件下杂交1.5 h,最后在LuxScan 10K扫描仪上采集荧光信号、判断检测结果。初步应用表明,该基因芯片检测方法具有良好的特异性和可靠性,在鱼类病毒高通量检测技术领域有广泛的应用前景。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立

试验根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,扩增大小为245 bp的目的片段,建立起PEDV N基因的RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法具有很强特异性和很高的敏感性,可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。     

H3N2亚型犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用

为了快速诊断H3N2亚型犬流感病毒(CIV)感染,根据H3N2亚型CIV的M和HA基因序列,设计了3组LAMP引物,优化反应条件,建立了H3N2亚型CIV的RT-LAMP检测方法。结果表明,RT-LAMP方法能在63℃恒温条件下,在45min内完成扩增,通过反应管中预加的荧光染料颜色的变化实现目视化判定。该方法对犬的常见病原无交叉反应,具有较好特异性;灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍。该方法操作简单、快速灵敏、特异性强,适合现场应用,对H3N2亚型CIV的检测具有实际的应用价值。     

Establishment and Application of A Double TaqMan MGB Real-time PCR Assay for Detection of Canine Distemper Virus and Canine Parvovirus

This study was aimed to establish a double TaqMan MGB Real-time PCR assay to simultaneously and specifically detect canine distemper virus (CDV) and canine parvovirus (CPV) in one reaction.Two pairs of specific primers for CDV and CPV,along with two TaqMan MGB probes for each virus were designed in the assay basing on CDV H gene and CPV VP2 gene sequences.The specificity,sensitivity and repetition of the double TaqMan MGB Real-time PCR assay were tested,and 48 samples taken from clinic suspicious CDV and CPV infected canines had been testified by the established double TaqMan MGB Real-time PCR.The results indicated that the doulde TaqMan MGB Real-time PCR assay was successfully established,and the number of standard curve correlation (R²) of CDV and CPV were 0.997 and 0.993,respectively.The specificity of the double TaqMan MGB Real-time PCR assay revealed that amplifications were showed on CDV and CPV samples,but other pathogens and negative controls had no amplifications;The sensitivity of CDV and CPV were both 10 copies/μL.Meanwhile,14 CDV positive samples,19 CPV positive samples and 4 CDV/CPV double positive samples were detected,which were consistent with the results of the sequencing.Therefore,the established double TaqMan MGB Real-time PCR assay had high sensitivity,specificity and flux accurate quantitative,which could be applied to clinical CDV/CPV infection each periods.     

非洲马瘟病毒、西尼罗病毒和马冠状病毒的基因芯片检测技术研究

为探索建立马病病毒基因芯片检测方法,采用人工拼接的方式拼接了非洲马瘟病毒(ASHV)核酸序列,通过分子克隆技术获得西尼罗病毒(WNV)和马冠状病毒(ECV)的特异基因片段。用芯片点样仪逐点分配到处理过的玻片上,制备成检测芯片。以拼接、克隆的核酸序列为模板通过多重不对称RT-PCR进行特异性扩增和荧光标记后滴加到芯片上进行杂交,对杂交结果进行扫描检测和计算机软件分析。结果显示,制备的基因芯片可同时检测和鉴别上述3种病毒,ECV质粒样品、WNV质粒样品检测灵敏度为10²拷贝;AHSV质粒样品检测灵敏度为10⁴拷贝。其他病毒材料未出现荧光信号,验证了本方法的特异性。证明基因芯片技术可快速、准确和灵敏地同时进行多种病毒的检测。