紫花苜蓿高温诱导启动子pMsMBF1c的克隆与功能分析

植物耐热性受复杂而精细的调控。热诱导启动子能经济、高效的激活或关闭耐热调节途径关键基因的表达,在植物功能基因组研究与现代分子育种技术中起十分重要的作用。以紫花苜蓿耐热候选基因MsMBF1c的编码序列为基础,采用酶切连接的方法分离获得了其上游1748bp序列,生物信息学分析发现该区域具有HSE与GATA结合位点等2个与植物耐热调节相关的保守模体,此外还有5个ABA应答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF与DPBF)和2个MYB蛋白结合位点,说明MsMBF1c除了参与植物耐热性调节外,还可能参与其他抗逆性调节。构建pBI121-MsMBF1c::GUS双元载体转化野生型拟南芥,荧光定量分析热诱导后的转基因植物中GUS与AtMBF1c基因的表达发现其分别上调了5.4与4.8倍,并且高温诱导下转基因植株的组织化学染色分析同样证明MsMBF1c启动子显著受高温诱导。分离获得紫花苜蓿MsMBF1c启动子序列并转化拟南芥,并且从生物信息学、组织化学染色与基因表达等方面验证该序列能显著被高温诱导,为探讨紫花苜蓿耐热调控机制及通过分子生物技术改善紫花苜蓿耐热性提供理论支撑,最终为培育适应南方高温气候条件的紫花苜蓿新品种提供技术储备。     

紫花苜蓿高温诱导启动子pMsMBF1c的克隆与功能分析

植物耐热性受复杂而精细的调控。热诱导启动子能经济、高效的激活或关闭耐热调节途径关键基因的表达,在植物功能基因组研究与现代分子育种技术中起十分重要的作用。以紫花苜蓿耐热候选基因MsMBF1c的编码序列为基础,采用酶切连接的方法分离获得了其上游1748bp序列,生物信息学分析发现该区域具有HSE与GATA结合位点等2个与植物耐热调节相关的保守模体,此外还有5个ABA应答元件(ABRE、MYB2、MIC2、CBF与DPBF)和2个MYB蛋白结合位点,说明MsMBF1c除了参与植物耐热性调节外,还可能参与其他抗逆性调节。构建pBI121-MsMBF1c::GUS双元载体转化野生型拟南芥,荧光定量分析热诱导后的转基因植物中GUS与AtMBF1c基因的表达发现其分别上调了5.4与4.8倍,并且高温诱导下转基因植株的组织化学染色分析同样证明MsMBF1c启动子显著受高温诱导。分离获得紫花苜蓿MsMBF1c启动子序列并转化拟南芥,并且从生物信息学、组织化学染色与基因表达等方面验证该序列能显著被高温诱导,为探讨紫花苜蓿耐热调控机制及通过分子生物技术改善紫花苜蓿耐热性提供理论支撑,最终为培育适应南方高温气候条件的紫花苜蓿新品种提供技术储备。     

紫花苜蓿耐热性研究进展

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)被称为"牧草之王",因其产量高、品质好、适口性优、适应性强,是奶牛饲养业和草食畜禽的主要饲草来源。在我国南方地区,高温热害是紫花苜蓿推广利用的主要限制因子,对紫花苜蓿的正常生长、产量和品质造成严重影响。本文综述了高温胁迫对紫花苜蓿细胞膜系统、渗透调节系统、抗氧化防御系统及光合系统的影响,并对紫花苜蓿耐热机制的研究方向进行了展望,以期为进一步探究紫花苜蓿的耐热性提供参考。     

MsNHX1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定

以紫花苜蓿"中苜1号"(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1)7日龄无菌苗子叶为外植体,建立适用于农杆菌介导的转基因组织再生体系,并进行MsNHX1基因转化试验。MsNHX1基因编码"中苜1号"液泡膜Na /H 逆向转运蛋白,将其转化到"中苜1号"中,以期获得耐盐性更好的苜蓿材料。利用PCR技术、RT-PCR技术及Dot Blotting技术对转基因植株进行鉴定,结果显示:MsNHX1基因已经整合到"中苜1号"基因组内,并且可以转录为mRNA。     

应用隶属函数法评价10个紫花苜蓿品种的耐热性

以10个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种作为试验材料,采用盆栽法探究38℃/35℃(昼/夜)高温胁迫对其生长和生理特性的影响,并用隶属函数法综合评价其耐热性,筛选耐热性较强及热敏感性紫花苜蓿品种.结果 表明:在高温胁迫处理下,紫花苜蓿的各项生长指标和叶绿素含量均低于对照;丙二醛(MDA)含量均大于对照;可...     

紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析

HD-Zip(Homologous structural Domain-leucine Zip,同源结构域-亮氨酸拉链)蛋白是植物特有的转录因子,其中HB1属于HD-ZIP I亚族。通过调节植物体内的内源激素含量变化,HB1转录因子可以提高植物对干旱、高盐等不利环境的抵抗能力。本文为探究紫花苜蓿HB1基因的生物学功能,采用RT-PCR技术成功克隆了MsHB1基因。其编码区长867 bp,编码288个氨基酸。氨基酸序列分析结果表明,HB1蛋白为不稳定蛋白。系统发育树分析表明HB1蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)同源蛋白的亲缘关系接近。构建MsHB1的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功诱导紫花苜蓿MsHB1蛋白表达,Western Blot也证实MsHB1蛋白表达成功。表达分析显示：MsHB1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中均有表达,在不同发育阶段中,幼嫩的叶片中表达最高。MsHB1在NaCl和ABA处理时的基因表达水平升高,推测MsHB1可能在紫花苜蓿高盐等胁迫应答方面发挥着重要的作用。     

农杆菌介导的smt1富硒基因转化紫花苜蓿研究

利用遗传转化,将硒富基因转入紫花苜蓿（Medicago sativa）是提高苜蓿富硒能力,解决当前硒不足问题的有效途径之一。本研究以“中苜1号”紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将来自硒超富集植物二沟黄芪(Astragalus bisulcatus)的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因(smt1)转入苜蓿,并以3 mg·L-1潮霉素进行筛选,获得转化植株10株。结果表明,5株均能扩增出与smt1基因大小相符的条带。RT PCR检测结果表明,2株目的基因表达呈阳性,这表明smt1基因已成功转入紫花苜蓿基因组中,且可以在植株中正常表达。     

口蹄疫病毒VP1基因在转基因拟南芥种子中的表达及活性检测

构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,在根癌农杆菌GV3101的介导下,通过浸花法转化拟南芥花序,转基因拟南芥通过卡那霉素抗性筛选后,进行了目的基因PCR扩增和ELISA检测,对ELISA筛选的阳性植株进行Western blot检测,并对转基因拟南芥后代进行了目的基因PCR分析.结果表明,种子特异性表达载体p7SBin438/VP1构建正确,FMDV结构蛋白VP1编码基因已整合进拟南芥基因组并获得表达,表达蛋白具有免疫反应活性,转基因拟南芥后代分析表明VP1基因已经遗传给后代.本试验为将FMDV免疫基因向豆科植物种子中的转化提供了依据.     

秋眠级不同的紫花苜蓿苗期耐热性评价

选择具有代表性并能真实地反映植物耐热性的多项指标对4种秋眠级不同的紫花苜蓿品种苗期耐热性进行综合评价.热害指数及恢复指数的分析结果表明,WL-525HQ耐热性较强,而WL-232HQ耐热性较差;采用隶属函数分析结果显示.4个紫花苜蓿品种的耐热性顺序为:WL-525HQ>WL-414HQ>WL-323HQ>WL-232HQ,秋眠级高的紫花苜蓿品种耐热性较强.     

紫花苜蓿MsSOS1基因的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SOS1（salt overly sensitive 1）是植物在抵御盐胁迫过程中一个重要的必需基因之一。本研究在紫花苜蓿（Medicago sativa）叶片中克隆得到一个MsSOS1基因,编码859个氨基酸,具有一个CAP-ED superfamily结构域、一个Crp superfamily结构域和一个Na⁺/H⁺ Exchanger superfamily结构域。与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆、花生和葡萄的一致性分别是91%,87%,85%,84%和77%。实时荧光定量PCR分析表明,MsSOS1基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中在根中的表达量最高,花中最低。此外,MsSOS1基因在4℃、PEG和ABA的胁迫中的表达均受到调控,推测该基因的表达与紫花苜蓿的抗逆性有关。     

4个苜蓿品种对豌豆蚜的抗性评价

在大田和室内条件下,采用大量蚜虫侵染幼苗法评价4个苜蓿（Medicago sativa）品种对豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）的抗性,以筛选出对豌豆蚜高抗的材料。结果表明,甘农5号（HA 3）在大田和室内的抗性植株百分率均显著高于其他品种,分别为50.3%和48.9%,而猎人河的抗性植株百分率在大田和室内均较低,分别为4.0%和4.3%;4个苜蓿品种在大田的抗性级别为甘农5号高抗,甘农3号、金皇后、猎人河均为感虫,室内抗性级别为甘农5号抗虫,金皇后、甘农3号低抗,猎人河感虫。     

16个紫花苜蓿品种维生素E含量测定与分析

采用高效液相色谱法测定16个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种新鲜叶片中维生素E(VE)的含量,并且对主要的维生素E组分-VE、-VE进行分析。结果显示,16个苜蓿品种VE总量介于1.833~6.346 mg100 g-1 FW,平均值为3.281 mg100 g-1 FW,其中VE总量最高为中苜1号（Medicago sativa cv. Zhongmu No.1）,为6.346 mg100 g-1 FW;总量最低为敖汉苜蓿（M. sativa cv. Aohan）,含量为1.833 mg100 g-1 FW。所有参试品种中,-VE和-VE含量呈偏态分布,-VE为VE的主要成分,-VE含量明显低于-VE。相关性分析表明VE总量与-VE,-VE与-VE呈极显著正相关关系（P＜0.01）。通过对16个品种的VE含量比较研究,发现中苜1号,雷达克之星（M. sativa cv. Ladak）和新疆大叶苜蓿（M. sativa cv. Xinjiangdaye）3个高VE含量的品种,为紫花苜蓿的利用和品质选育提供了试验依据。     

紫花苜蓿镰刀菌根腐病研究进展

紫花苜蓿(简称苜蓿)是我国和世界种植面积最大最重要的豆科牧草。由镰刀菌引起的根腐病(称为镰刀菌根腐病)是苜蓿生产上的主要限制因素之一,严重影响该牧草的产量和品质,导致草地衰败和利用年限缩短。镰刀菌作为一类重要的土传病原真菌,一直是苜蓿根腐病研究的热点。由于镰刀菌能在土壤中长期存活,且苜蓿为多年生牧草,导致苜蓿根腐病的防治尤为困难。从苜蓿镰刀菌根腐病的分布与危害、病原种类与生物学特性、侵染源及发病规律、镰刀菌对苜蓿的致病性及致病机理、苜蓿品种对镰刀菌的抗病性以及防治方法等方面阐述苜蓿镰刀菌根腐病的研究进展,并对今后的研究方向进行了展望,以期为苜蓿镰刀菌根腐病后续研究及其防治新方法的开发利用提供理论依据。     

全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析

紫花苜蓿是世界最重要的豆科牧草之一,干旱是影响其产量和地理分布的关键瓶颈。在紫花苜蓿响应干旱胁迫过程中,转录因子发挥着重要的调控作用。TCP（teosinte branchesd 1/cycloidea/pro-liferating cell factors）为植物特有的转录因子,在植物生长、发育、响应逆境胁迫中都具有重要的生物学功能。截至目前,该基因家族在紫花苜蓿中的分布以及响应干旱胁迫的生物学功能仍未见报道。因此,为进一步挖掘紫花苜蓿中响应干旱胁迫功能基因,本研究利用生物信息学方法在全基因组水平对TCP基因家族进行了鉴定,并对其系统进化、基因结构、染色体定位、共线性分析以及干旱胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明,紫花苜蓿基因组中共鉴定出40个MsTCP基因,不均匀地分布于20条染色体上,其中包括17对旁系同源基因对,且都是基因片段复制事件。系统发育和保守结构域分析发现,MsTCP基因可以分为2个大分支和3个亚家族（PCF, CIN与CYC/TB1）,同一分支中的成员具有相同氨基酸数目的TCP结构域,同亚家族中的成员具有相似的保守基序与基因结构。此外,通过分析紫花苜蓿响应干旱转录组数据共鉴定出4个可能与紫花苜蓿响应干旱胁迫有关的MsTCP基因（MsTCP23,MsTCP27,MsTCP29,MsTCP33）。qRT-PCR结果进一步表明PEG模拟干旱胁迫处理后,这4个基因的表达量在根和叶中均显著上调,进一步确定了这些基因的确响应紫花苜蓿干旱胁迫。该研究为后期深入解析紫花苜蓿响应干旱胁迫理论以及通过基因工程技术创制高抗旱紫花苜蓿新种质奠定基础。     

施磷、钾肥及微肥对紫花苜蓿种子产量影响的研究进展

查阅大量资料,讨论了在紫花苜蓿种子生产中,施用P肥可促进根系的发生和生长,促进花芽分化,有利于提高种子产量,增强牧草的抗旱、抗寒性能;K肥可促进枝条的横向发展,使子粒增大,种子产量提高,同时可提高牧草的抗寒、抗旱、耐高温和抗病虫能力。众多的报道论述了B,S和Mo等微肥通过增加紫花苜蓿的花序数/枝条、豆荚数/花序和子粒数/豆荚等种子产量构成因素,来促进生殖生长,提高种子产量。     

凋萎和不同添加剂对紫花苜蓿青贮品质的影响

以孕蕾后期至初花期紫花苜蓿为材料,在实验室条件下研究了两种凋萎程度(晾晒3 h和晾晒12 h),对应含水率分别为72.6%和61.8%的苜蓿草分别添加乳酸菌接种剂(LAB)、甜菜粕(SB)、乳酸菌+甜菜粕(LAB+SB)、甲酸钠(SF)、甲酸钠+甜菜粕(SF+SB)五组不同添加剂处理及对照组(CK)对苜蓿青贮发酵品质和主要营养成分含量的影响。青贮65 d开封,对青贮进行了感官评定和实验室评定。结果表明,1)添加剂对苜蓿青贮发酵品质有极显著的影响(P<0.01),各种添加剂均不同程度地提高了苜蓿青贮饲料的发酵品质,显著降低了青贮饲料的pH和氨态氮含量;2)两种凋萎程度下苜蓿青贮的NDF、ADF和干物质回收率均与对照组差异不显著,LAB+SB和SF处理显著提高了青贮饲料WSC的含量(P<0.05),添加SB显著降低了青贮饲料的CP值(P<0.05);3)提高原料的凋萎程度能够改善苜蓿青贮饲料的发酵品质,显著提高青贮饲料的CP和WSC含量(P<0.05)。总体来说,不同添加剂的青贮效果不同,添加LAB+SB的青贮品质最佳。     

紫花苜蓿和裸燕麦混贮发酵品质和营养成分分析

以新鲜及晾晒后的紫花苜蓿和裸燕麦为原料,分别设计紫花苜蓿单贮、裸燕麦单贮、裸燕麦∶紫花苜蓿=1∶1、裸燕麦∶紫花苜蓿=2∶1及裸燕麦∶紫花苜蓿=1∶2混贮等5个处理,青贮60 d后,对其感官评分、发酵品质和营养成分等进行分析。结果表明,鲜贮苜蓿在感官评定、V-Score及Kaiser评价体系中表现一般,而晾晒及混合青贮各处理组均能不同程度提高青贮评分。晾晒和混合青贮对发酵品质产生影响,两者显著或极显著降低pH值、 PA(丙酸)、AA(乙酸)、BA(丁酸)和AN/TN(氨态氮/总氮)含量(P＜0.01或P＜0.05),显著或极显著升高LA(乳酸)含量(P＜0.01或P＜0.05),其中以裸燕麦∶紫花苜蓿=2∶1降低或升高最明显。晾晒对青贮饲料的干物质、可溶性碳水化合物及粗灰分含量具有显著或极显著影响(P＜0.05或P＜0.01),对其他养分含量影响不大(P>0.05)。混合比例对青贮饲料的所有发酵项目均有极显著影响(P＜0.01),对粗蛋白质、可溶性碳水化合物及中性洗涤纤维含量具有显著或极显著影响(P＜0.05或P＜0.01),对其他养分指标影响不显著(P>0.05)。晾晒和混合青贮的交互作用可显著提高青贮饲料的发酵品质,但对养分含量影响不明显。因此,从青贮后感官评价、发酵品质及养分含量来看,紫花苜蓿和裸燕麦混合青贮品质优于单独青贮,且晾晒相对于鲜贮更易于青贮,而无论晾晒和鲜贮,当裸燕麦∶紫花苜蓿=2∶1时,青贮品质均优于其他各组。     

宁夏主栽苜蓿品种(系)对豌豆蚜的抗性评价

运用蚜量比值法和模糊识别法,对12个宁夏主栽苜蓿品种(系)进行了田间和室内抗蚜评价试验。田间蚜虫种类以豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)为主,占混合种群数量的80%以上。田间和室内结果综合分析表明:供试12个苜蓿品种(品系)中,惊喜、WL343HQ和德宝3个品种为高感品种,其蚜量比值均大于1.25,并与其他品种间差异极显著;柏拉图、中苜3号、甘农4号等3个品种为感蚜品种,其蚜量比值位于0.76~1.25之间;先行者为中抗品种,蚜量比值为0.51,位于0.51~0.75之间;皇冠、三得利、皇后、SR4030和MF40205等5个品种为抗蚜品种,其蚜量比值 0.26~0.50之间。同时,本研究也提出了室内和田间苜蓿抗蚜鉴定方法分别为模糊识别法和蚜量比值法的评价方法和标准。     

镉污染和接种丛枝菌根真菌对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响

采用盆栽试验研究在3个镉污染(0,6和12 mg Cd/kg)水平下,接种5种丛枝菌根真菌[分别接种聚丛球囊 Glomus aggregatum(Ga)、幼套球囊霉 G. etunicatum (Ge)、扭形球囊霉 G. tortuosum(Gt)、根内球囊霉 G. intraradices(Gi)和地表球囊霉 G. versiforme(Gv),以不接种为对照]对紫花苜蓿生长和氮吸收的影响。结果表明:与不加镉(0 mg Cd/kg)处理相比,接种Ga、Gi 和Gt菌种处理的紫花苜蓿菌根侵染率在12 mg Cd/kg条件下降低了33.90%、19.17%和31.95%;0 mg Cd/kg水平下接种Gt菌种紫花苜蓿总生物量分别比接种 Ga、Ge、Gi和Gv菌种处理显著高出33.19%、67.74%、57.29%和34.91%,但在12 mg Cd/kg水平时总生物量与以上菌种处理相比,分别降低16.67%、34.07%、32.96%和52.76%;在镉浓度为12 mg Cd/kg时,接种Gv菌种处理的紫花苜蓿株高、根瘤菌数量、地上生物量、总生物量、地上植株氮含量和整株含氮量与不接种处理相比,分别增加 65.41%、95.24%、61.87%、50.30%、5.83%和71.55%;随镉浓度增加接种Gv菌种处理紫花苜蓿土壤中铵态氮(NH₄⁺-N)和硝态氮(N₃^--N)浓度显著下降。综上分析,在镉污染条件下,接种Gv菌种能促进紫花苜蓿生长和氮吸收;当土壤镉浓度超过6 mg Cd/kg时,接种Gt菌种不利于紫花苜蓿的生长。