HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸-酪氨酸蛋白(HGTP)启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著(P0.01),HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关(P0.01),与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关(P0.05),而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关(P0.01)。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著(P0.01)。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性(P0.01)。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

牛Ankrd2基因启动子遗传多态性及启动效率分析

采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术,检测462头中国西门塔尔牛Ankrd2基因启动子区域的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,分析了SNP位点与牛肉质和胴体性状的关联性,利用生物信息学网站和软件对启动子序列进行预测分析;另一方面,采用点突变构建含有SNP位点不同基因型的双荧光素酶报告基因载体,分别瞬时转染293T细胞和牛胎儿成纤维细胞,测定荧光素酶的相对活性并进行统计学分析。结果显示:牛Ankrd2基因启动子区域(-2101～+436 bp)中存在1个SNP位点:g.-171G>T,该位点在检测的牛群体中仅存在2种基因型:GG和GT,其中G为优势基因,且该位点对牛肺和气管重影响达到显著水平(P<0.05),当G突变为T时,启动子序列减少2个ZF5转录因子结合位点,增加了1个FACB转录因子结合位点,pGL4-Ankrd2-TT启动子启动效率极显著低于野生型载体pGL4-Ankrd2-GG(P<0.01)。结果表明,在中国西门塔尔牛群体Ankrd2基因启动子区存在g.-171G>T,位点与牛胴体性状存在相关性,且该位点可能通过改变转录因子结合位点,从而影响基因的启动子转录活性。     

猪乳糖酶基因启动子及增强子的活性研究

采用PCR、TA克隆、构建pGL3.0 Basic荧光素酶报告基因载体并转染Caco-2细胞、Dual-Glo萤光素酶检测系统检测细胞系中荧光信号值的方法分析猪乳糖酶基因不同基因型的启动子与增强子活性。结果表明:GA型启动子和CG型启动子相比差异极显著(P=0.001),CG型启动子能显著促进猪LCT基因表达,而GA型启动子不能促进基因表达。A型增强子,可以使GA型启动子活性显著增强(P<0.05),使CG型启动子活性显著降低(P<0.01);G型增强子对GA型启动子或CG型启动子,均起显著的抑制作用(P<0.01)。猪LCT增强子和启动子多态性位点组合形成的单倍型促进基因表达的作用从高到低顺序为:A型增强子+GA型启动子>A/G型增强子+CG型启动子>G型增强子+GA型启动子。     

猪THRSP基因5'侧翼区序列转录调控活性的鉴定

本研究旨在对猪THRSP基因5′调控区TP526序列进行转录调控活性的鉴定,以鉴别THRSP基因调控区的功能。提取猪耳组织基因组,利用PCR技术克隆THRSP基因5′调控区TP526序列,将其插入荧光素酶报告载体中(pGL3-Basic),构建猪THRSP基因5′调控区TP526序列调控的荧光素酶报告载体(pGL3-TP526/promot-er),经PCR鉴定后,转染293T细胞,利用双报告基因检测TP526序列的启动子活性。结果显示,pGL3-TP526/promoter调控的表达载体,其萤火虫与海肾荧光素酶荧光强度之比(1.816 2±0.253 3)显著高于pGL3-Basic(0.126 7±0.020 3),呈高效表达(P<0.01)。THRSP基因5′调控区TP526序列具有启动子调控活性。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

奶山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)基因启动子的克隆及活性分析

心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)是一种15 kDa的蛋白,涉及信号转导途径,参与长链脂肪酸的摄取及利用.本研究采用PCR技术扩增FABP3启动子序列,通过缺失分析构建了5个不同缺失片段荧光素酶报告基因载体,并转染奶山羊乳腺上皮细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测FABP3缺失片段启动子活性.结果表明:从奶山羊基因组中...     

利用绿色荧光蛋白报告基因筛选植物乳杆菌强启动子

[目的] 结合已知植物乳杆菌启动子和绿色荧光蛋白报告基因,筛选能够进行稳定强表达的启动子,为构建植物乳杆菌高效特异表达载体提供基因元件。[方法] 分别合成已知植物乳杆菌启动子P11、Pefp、Ptuf33和Ptuf34及其下游绿色荧光蛋白报告基因,并使用上述合成序列分别替代pMG36e乳酸菌表达载体原有多克隆位点及其上游启动子部分,形成启动子筛选载体。利用电转方法将成功构建的启动子筛选载体转化至植物乳杆菌,通过检测重组子绿色荧光信号强弱对比分析启动子强弱特性。[结果] 4个启动子中转录延伸因子TU基因启动子Ptuf33和Ptuf34在受体植物乳杆菌中表达目的基因水平显著（P<0.05）高于其他启动子。[结论] 结合该研究结果及相关报道可知,启动子Ptuf33和Ptuf34在植物乳杆菌中普遍高表达,可以为后续高表达植物乳杆菌载体构建提供元件。     

KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3（KLF3）基因3'-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3'-UTR序列,将其克隆到经Xho Ⅰ、Not Ⅰ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3'-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组（0.6900±0.0144）比突变组（1.000±0.0688）和空白对照组（1.000±0.0159）KLF3基因3'-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%（P<0.01）。本试验成功构建了含有KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

报告基因在监测基因转移中的应用新进展

绿色荧光蛋白（GFP）和虫荧素酶（luc)等报道分子的应用使人们能够对基因的转移和表达进行灵敏的监测。对GFP进行修饰可增加其荧光强度和热稳定性，同时也改变了它的光学特性，因而使GFP在进行基因转移时发挥出更大的作用。成像技术的改进及其在生物学研究方面日益广泛的使用，推动了luc在基因转移，尤其是在基因表达过程中进行基因筛选以及在监测温度变化时的应用。     

蒙古羊GDF11基因启动子区克隆及序列分析

为了研究生长分化因子11(growth differentiation factor,GDF11)基因与蒙古羊多脊椎性状间的关系,本研究首先克隆了该基因启动子区序列,并采用相关生物信息学软件对该序列进行了分析。结果得到512 bp的蒙古羊GDF11基因启动子区序列,整个序列碱基构成为A占10.55%,G占16.80%,T占31.84%,C占40.82%,整个序列G+C含量百分比为57.62%。通过在线软件对蒙古羊GDF11基因启动子区生物信息学分析结果表明,该区域未找到符合条件的CpG岛,也未发现TATA box或CAAT box结构,但存在一处潜在的转录起始位点和HSF2、HSF2、GATA-1、AML-1a和MZF1 5个潜在转录因子,并且具有5种基序结构:EGF_1、CTCK_1、ANAPHYLATOXIN_1、VWFC_1和DEFENSIN。本研究结果为进一步揭示该基因对蒙古羊脊椎数的调控机理提供了重要的理论依据。