脂多糖对奶牛子宫内膜上皮细胞毒性作用研究

本试验通过传代培养奶牛子宫内膜上皮细胞,以0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL 7个LPS浓度梯度刺激细胞,分别于刺激后12h、24h、36h 3个时间段做MTT细胞毒检测,同时进行细胞形态学观察,研究LPS对子宫内膜上皮细胞的毒性作用。结果发现：0.1μg/mL、1μg/mLLPS组细胞形态学无明显改变;10μg/mL、50μg/mL、100g/mL LPS组细胞形态学与对照组相比有明显改变,500μg/mL、1000μg/mL LPS组细胞发生裂解、死亡。MTT试验结果表明LPS对细胞的抑制作用呈浓度与时间依赖关系,随着LPS浓度的增加和刺激时间的延长,细胞抑制率明显增加,细胞活力明显降低。     

孕酮对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡和容受性的影响

为研究孕酮对奶牛早期胚胎附植的影响,本试验使用不同质量浓度孕酮处理奶牛子宫内膜上皮细胞,CCK8检测细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因(p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3)和容受性相关基因(TLR-4、NF-κB、IL-6、VEGF、LIF和EGF)的mRNA和蛋白表达变化。结果显示：10,25,50,100μg/L孕酮对细胞活力未见影响;10,100μg/L孕酮对细胞凋亡未见影响,对细胞p53、Cyto-c、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的mRNA及蛋白的表达未见影响,但显著下调了TLR-4 mRNA和蛋白表达水平,显著上调了LIF和VEGF mRNA和蛋白表达水平。结果表明孕酮不影响奶牛子宫内膜上皮细胞的凋亡,但能提高子宫容受性,降低免疫反应。     

荷斯坦奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养

为建立和完善奶牛子宫内膜上皮细胞的体外培养技术,采用组织培养和胶原酶消化相结合的方法,对中国荷斯坦奶牛的子宫内膜上皮细胞进行了原代分离培养,经胰酶差时消化进行纯化,并以免疫组化法检测角蛋白表达。结果显示,所采用的方法可高效获得呈铺路石样的上皮细胞,角蛋白表达呈阳性,第2~8代的传代细胞在形态特征和增殖状态上保持着与原代细胞相近的生物学特征。     

原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养方法的改进

目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术,建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法,因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节,国内外所使用方法主要是酶消化法、组织块贴壁法和组织块消化贴壁法。本文旨对先前的方法进行改良,建立一种简便易行、培养周期短、细胞活性及形态良好的原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术。采用健康未孕奶牛子宫为试验材料,取下子宫内膜组织,加入5 mL含2%双抗、40%胰酶的DMEM/F12培养基,4 ℃消化12 h,再将组织移至25 cm²细胞培养瓶中贴壁培养。获得原代细胞后,应用角蛋白-18抗体对细胞进行免疫组化荧光鉴定,并对第3代细胞采用CCK-8法测定不同时间点的D_{450 nm}值,绘制细胞生长曲线。结果显示,培养至第8天,原代细胞基本铺满细胞培养瓶瓶底,有效地缩短了常规组织块贴壁法的周期。通过角蛋白-18免疫组化荧光鉴定,原代上皮细胞的阳性率可达98%以上,相比常规组织块贴壁法来说,纯度明显提高,省去了细胞纯化的操作步骤。细胞增殖状态,符合正常的分裂生长特性。试验结果表明将常规组织块贴壁法进行了优化改良,不仅缩短了培养周期,同时提高纯度,保持细胞活性,为原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术的改良提供一定的参考。     

脂多糖对体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞子宫容受性因子表达的影响

试验旨在通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞构建子宫内膜炎体外感染模型,研究子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子大分子转膜黏蛋白-糖蛋白1(MUC-1)、高度保守的分泌型WNT家族亚型糖蛋白(Wnt-7a)、β受体1(IFNAR1)、IFNAR2、Integrinαvβ3 mRNA及蛋白相对表达量的影响,进而阐明子宫内膜炎引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的机制。采用组织块法分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞,免疫荧光方法鉴定细胞纯度,不同浓度LPS刺激子宫内膜上皮细胞,在不同时间点用CCK8测定细胞存活率,ELISA检测炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8的分泌变化,实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测子宫内膜感染模型中子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrinαvβ3 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示,通过组织块法纯化获得的奶牛子宫上皮细胞数量较多,经免疫荧光角蛋白染色证实纯度较高。采用CCK8测定细胞存活率发现,与对照组相比,浓度为0、5、10、50μg/mL的LPS作用6、12、24、48 h后,细胞活力无显著变化(P0.05);浓度为100μg/mL的LPS作用24 h时,细胞存活率显著低于对照组(P0.05),细胞培养上清中的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8含量均显著高于对照组及低浓度组(P0.05),引起细胞的炎症反应。与对照组相比,模型组MUC-1 mRNA及蛋白的相对表达量均极显著增加(P0.01);Wnt-7a mRNA及蛋白的相对表达量均极显著下降(P0.01);Integrinαvβ3、IFNAR1和IFNAR2 mRNA相对表达量均极显著下降(P0.01),蛋白相对表达量均显著下降(P0.05)。结果表明,浓度为100μg/mL的LPS作用24 h可成功构建子宫内膜炎体外感染模型,子宫内膜炎对奶牛子宫容受性因子MUC-1、Wnt-7a、IFNAR1、IFNAR2、Integrinαvβ3 mRNA及蛋白表达的影响可能是引起奶牛屡配不孕和繁殖率低下的重要原因。     

奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养及鉴定

试验采用酶消化及机械法相结合的方法培养奶牛子宫内膜上皮原代细胞及传代细胞。酶消化法采用0.1%链蛋白酶于4 ℃消化16~20 h,机械法采用手术刀刮取子宫角内膜。获得原代分离的细胞后,采用胰蛋白酶消化法进行细胞的传代培养。试验应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定,并对第3代奶牛子宫内膜上皮细胞用MTT法绘制增殖曲线。结果显示,细胞在相差显微镜下呈明显的上皮样细胞形态,细胞传代到第8代时,仍能保持与原代细胞相似的细胞形态特征及生长状态。同时细胞角蛋白染色阳性细胞占80％以上。试验结果表明,应用酶消化和机械法可成功分离并培养数量、活力和纯度均较高的子宫内膜细胞,可操作性强,可在具备基本细胞培养条件的实验室应用推广。     

川芎嗪对LPS致伤奶牛子宫内膜上皮细胞的TLR4和BNBD4 mRNA表达的影响

为探讨脂多糖(LPS)对奶牛子宫内膜上皮细胞TLR4和BNBD4 m RNA表达的影响及川芎嗪的调控作用,体外培养奶牛子宫内膜上皮细胞,并分为对照组、LPS组、川芎嗪组(高、中、低浓度),利用实时荧光定量PCR法对各组细胞TLR4和BNBD4 m RNA表达进行了检测。结果表明:LPS可显著刺激奶牛子宫内膜上皮细胞TLR4及BNBD4 m RNA表达显著升高(P0.05),川芎嗪可抑制LPS诱导子宫内膜上皮细胞TLR4升高作用,并能促进BNBD4 m RNA表达。提示川芎嗪可干预LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎症反应,并促进其分泌β-防御素起到改善子宫内膜炎的作用。     

皮质醇对LPS损伤的奶牛子宫内膜上皮细胞修复机制的影响

为了探索在奶牛子宫内膜上皮细胞(bovine endometrial epithelial cells,BEECs)发生炎性损伤时皮质醇对其修复方面的影响,本研究通过不同质量浓度的皮质醇(5,15,30 μg/L)与脂多糖(LPS)共处理原代奶牛子宫内膜上皮细胞,利用荧光定量PCR法检测生长因子TGF-β1、TGF-β...     

脂多糖治疗奶牛子宫内膜炎的研究

子宫内膜炎是引起奶牛不孕症的主要原因之一,给奶牛养殖业造成严重的经济损失.奶牛发生子宫内膜炎后,治疗方法很多,主要有子宫内灌注疗法和子宫内冲洗疗法,但对于应用这种方法治疗奶牛子宫内膜炎有很大的争议.     

NEFA经MMPs途径对奶牛子宫内膜上皮细胞Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

为了研究体外非酯化脂肪酸(NEFA)对奶牛子宫内膜上皮细胞基质金属蛋白酶(MMPs)、Ⅳ型胶原蛋白(COL-Ⅳ)和炎性因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α)分泌的调节作用,进而探讨NEFA对奶牛胎衣不下(RFM)发生的影响,使用不同浓度的NEFA刺激牛子宫内膜上皮细胞,采用qPCR和Western blot检测细胞中MMP-2、MMP-9、COL-Ⅳ、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的表达水平。结果表明,与对照组相比,低浓度组和高浓度组的MMP-2和COL-Ⅳ的mRNA表达极显著升高(P<0.01),MMP-9的mRNA极显著下调(P<0.01);IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA表达在高浓度组均极显著上调(P<0.01),在低浓度组,IL-6的mRNA被极显著上调(P<0.01),IL-8和TNF-α的mRNA被显著上调(P<0.05)。Western blot的结果显示,与对照组相比,高浓度组的MMP-2和COL-Ⅳ的蛋白表达极显著上升(P<0.01),MMP-9的蛋白表达显著下降(P<0.05)。结...     

蛋氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

研究蛋氨酸与乳蛋白合成及乳腺泌乳能力的关系。建立体外培养的奶牛乳腺上皮细胞模型,采用高效液相色谱法、实时荧光定量PCR、细胞活力分析仪、甘油三酯试剂盒检测不同浓度蛋氨酸(0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6mmol/L)对体外培养24h的奶牛乳腺上皮细胞泌乳的影响。结果表明,蛋氨酸在1.2mmol/L时对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞增殖的促进作用最明显,乳糖分泌量最高,β-酪蛋白mRNA表达量最高且甘油三酯合成最多(P<0.01)。     

前列腺素E2和F2α对LPS刺激后奶牛子宫内膜上皮细胞COX-1和COX-2表达的影响

试验旨在阐明前列腺素E₂（prostaglandin E₂,PGE₂）和F_2α（prostaglandin F_2α,PGF_2α）对体外培养的奶牛子宫内膜上皮细胞中环氧合酶-1（cyclooxygenase-1,COX-1））与环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）表达的影响。培养奶牛子宫内膜上皮原代细胞和传代细胞,第4代细胞以1×10⁶个/孔接种于6孔板,以10^-7mol/L PGE₂和PGF_2α分别预处理细胞24 h,以100 ng/mL细菌脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）刺激细胞4、8和12 h后分别提取RNA和总蛋白质,采用实时荧光定量PCR与Western blotting等技术检测COX-1与COX-2 mRNA和蛋白质的表达量。结果表明,与对照组相比,COX-1 mRNA表达量在PGE₂单独作用4、8和12 h后显著上调（P<0.05）;COX-2 mRNA表达量在PGE₂单独作用4和12 h后显著上调（P<0.05）,PGE₂单独处理使COX-1、COX-2蛋白表达量均显著上调（P<0.05）。与对照组相比,LPS刺激8和12 h时COX-1 mRNA表达量显著下调（P<0.05）,LPS刺激后COX-1蛋白表达量无显著变化（P>0.05）;LPS刺激后4、8和12 h时COX-2 mRNA表达量显著上调（P<0.05）,LPS刺激后COX-2蛋白表达量显著上调（P<0.05）。与LPS单独处理组相比,LPS+PGE₂处理组在8和12 h时COX-1和COX-2 mRNA表达量均显著上调（P<0.05）,同时COX-1和COX-2蛋白表达量也显著上调（P<0.05）。PGF_2α在LPS未刺激和刺激后对COX-1和COX-2 mRNA的表达无显著影响（P>0.05）,仅在PGF_2α单独处理8和12 h后COX-1 mRNA表达量上调（P<0.05）。两种激素联合处理与各自单独处理及LPS单独刺激相比,对COX-1和COX-2 mRNA表达具有一定的协同诱导作用。     

奶牛原代乳腺上皮细胞的培养及β酪蛋白mRNA的表达

本试验旨在建立原代乳腺上皮细胞系的体外培养方法,并进行β酪蛋白mRNA的表达验证。取新鲜泌乳期的乳腺组织,采用组织块法培养纯化原代乳腺上皮细胞,利用显微镜观察细胞形态并进行细胞生长计数,采用实时荧光定量PCR技术检测β酪蛋白mRNA表达。结果显示,纯化培养的原代乳腺上皮细胞集聚成岛屿状生长,具有典型的铺路石和鹅卵石形状,细胞生长曲线呈"S"形,符合一般细胞的生长规律,并成功表达β酪蛋白mRNA。综上所述,本研究采用组织块法成功培养出具有正常生理功能的奶牛原代乳腺上皮细胞,为后续的乳腺上皮细胞功能研究提供了良好的细胞试验模型。     

stat5高效表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响

本研究旨在检验构建的stat5表达载体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。构建真核表达载体pcD-NA3.1+-stat5-αS1,稳定转染到奶牛乳腺上皮细胞中。利用细胞活力分析仪、HPLC、Real-time PCR和WesternBlotting技术检测乳腺上皮细胞转染前后stat5基因和蛋白的表达量、细胞活力及乳糖和酪蛋白分泌情况。结果表明,与空白细胞和空白载体组相比,非磷酸化STAT5蛋白和stat5基因的表达量增加(P<0.01),乳糖含量提高(P<0.05),细胞活力和增殖能力增强(P<0.01),酪蛋白和磷酸化STAT5(pSTAT5)表达增多(P<0.05)。结果提示,构建的载体pcDNA3.1+-stat5-αS1在乳腺上皮细胞中高效表达,显著提高乳腺上皮细胞的泌乳能力。     

奶牛子宫内膜细胞体外培养及应用研究概况

子宫内膜细胞体外培养技术在研究动物子宫内膜生理功能、繁殖障碍疾病机制及治疗药物筛选等过程中具有重要的作用和意义。论文就国内外有关奶牛子宫内膜细胞体外培养技术中常用的分离、纯化和鉴定等方法以及该细胞体外模型相关应用进行综述,为探索简便、高效的奶牛子宫内膜细胞体外培养方法及国内有关奶牛子宫内膜生理病理的分子细胞学研究提供参考。     

阴外动脉注射脂多糖对奶牛临床症状及白细胞的影响

为观察泌乳奶牛阴外动脉注射脂多糖(lipopolysaccharides ,LPS)后对临床症状及白细胞(WBC)的影响,选用6头泌乳后期的中国荷斯坦奶牛,用注射LPS处理和空白对照交叉试验设计,每期试验持续一周,期间3头牛进行阴外动脉LPS注射(Escherichia coli 0111:B4,0.01 μg LPS/kg体重),另外3头牛在阴外动脉注射生理盐水。结果表明,与对照组相比,注射LPS极显著影响奶牛的呼吸频率(P＜0.01),在注射后3 h达到最高;注射LPS后对奶牛直肠温度没有影响;注射LPS极显著影响奶牛脉搏(P＜0.01),在注射后6 h达到最高;注射LPS极显著影响奶牛血液中WBC数(P＜0.01),且对其分类计数没有影响。因此,当给奶牛阴外动脉注射LPS后,会影响奶牛的临床症状和WBC数。     

阴外动脉注射LPS奶牛的血浆蛋白质组变化研究

为了检测阴外动脉注射低剂量脂多糖(LPS)后泌乳期奶牛血浆蛋白的变化,以揭示LPS刺激机体应答的分子机制.本研究选择6头泌乳中后期的健康奶牛,均经阴外动脉注射LPS(0.01μg·kg-1体质量)后分别在不同时间点(注射后0、3、6、9、12、24、36、48、60、72、84和96 h)采集奶样和血样,采用双向电泳与质谱相结合的方法,双向电泳技术分离血浆蛋白,考马斯亮蓝G-250染色后用PDQuest 8.0.1软件自动检测差异蛋白斑点,并经MALDI-TOF-TOF进行质谱鉴定.结果,牛奶体细胞评分在注射LPS后上升,6h达到最大值,此后逐渐下降,24 h恢复到注射前水平.0、6、12和24 h血浆蛋白凝胶图谱分析后发现,8个蛋白点在6、12和24 h表达量升高,质谱鉴定为4种蛋白质(VD-结合蛋白前体、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-6、α1-抗胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-1前体).这些蛋白在LPS注射后6、12和24 h表达量显著高于0 h(P＜0.05),但它们在6～24 h之间的表达量无显著差异.VD-结合蛋白前体、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-6、α1-抗胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂A3-1前体在机体免疫调节中具有重要作用,这些蛋白的鉴定为揭示奶牛机体对LPS刺激应答的分子机制提供了基础资料.     

大豆黄酮和染料木素对体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖及抗氧化水平的影响

通过体外细胞培养的方法探讨大豆黄酮（Daidzein,Da）和染料木素（Genistein,Ge）对奶牛乳腺上皮细胞增殖及抗氧化水平的影响。试验分空白对照组、10ng／mL雌二醇（Ez）组、不同浓度Da和Ge（1、10、100、1000ng／mL）组,培养72h后,采用MTT法检测细胞增殖情况。结果表明,10、100ng／mLGe组和100、1000ng／mLDa组同空白对照组比较可显著促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖（P〈0．05）,但均显著低于E2组（P〈0．05）。另取处于对数生长期的乳腺上皮细胞加入不同浓度Da和Ge（1、10、100、1000ng／mL）继续培养24h,检测细胞培养液中总超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）活性、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量。结果表明,100、1000ng／mLDa组及100、1000ng／mL Ge组较空白组显著提高了T—SOD活性（P〈0．05）,显著降低了MDA含量（P〈0．05）;100、1000ng／mL Da组及10、100、1000ng／mL Ge组显著提高了NO含量（P〈0．05）;1000ng／mL Da组及100、1000ng／mL Ge组显著提高了GSH—PX活性（P〈0．05）。可见,Da和Ge在一定浓度范围内均有促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及抗氧化水平提高的作用。