4种有机溶剂对Vero细胞活力和弓形虫增殖的影响

本研究旨在筛选低细胞毒性和低弓形虫毒性的有机溶剂。Vero细胞在96孔板培养12 h后,将培养基更换为200μL分别含0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%、5%、10%(V/V)的二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇的完全培养基,同时设立空白对照孔,继续培养12和24 h后,采用噻唑蓝(MTT)法评价4种有机溶剂对Vero细胞增殖活力的影响,筛选出对宿主细胞毒性最小的有机溶剂并确定其安全浓度;弓形虫接种Vero细胞12 h后,弃上清后分别加入含有0、0.1%、0.3%、0.5%、1%、3%(V/V)的DMSO、二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇的完全培养基120μL,接种36 h后判定各组溶剂对弓形虫增殖的影响,计数感染细胞数并计算相对感染率,筛选出对弓形虫增殖影响最小的有机溶剂及其安全浓度。结果显示,对于Vero细胞,DMSO、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇分别在其体积分数低于1%、0.1%、3%和1%时无明显毒性;对于弓形虫,DMSO、二甲基甲酰胺、甲醇和乙醇对弓形虫增殖的安全添加浓度分别为1%、0.1%、1%和0.1%。本研究表明,DMSO、甲醇对Vero细胞、弓形虫的毒性较小,可作为水溶性较差药物进行抗弓形虫筛选时优先选择的有机溶剂。     

桧烯抗弓形虫活性的体外评价

本研究旨在筛选具有抗弓形虫活性的萜类化合物,并进行体外活性评价。对26个萜类化合物进行体外抗弓形虫增殖作用的筛选,采用CCK-8法确定活性化合物对Vero细胞的毒性和安全浓度,Giemsa染色进一步确定对弓形虫的活性,通过细胞免疫荧光、Giemsa染色和生物化学发光法评价活性化合物对弓形虫的体外活性。结果表明,26个萜类化合物中,桧烯对弓形虫有显著的活性,桧烯对RH-2F的IC₅₀为90.76 μg·mL^-1,Giemsa染色和细胞免疫荧光的结果表明,桧烯对细胞内的两种弓形虫虫株都有显著的抗增殖作用,并且对弓形虫的入侵有极显著的抑制作用（P<0.001）。综上表明,桧烯对弓形虫的入侵和细胞内增殖具有显著的抑制作用,可作为潜在的抗弓形虫先导化合物。     

H9N2亚型猪源性流感病毒在小鼠肺微血管内皮细胞内最佳增殖条件的研究

试验旨在确定H9N2亚型猪源性流感病毒（SIV）在小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）中增殖的最佳条件。将PMVEC解冻、复苏、培养,取长成单层的PMVEC,在不同浓度TPCK-胰蛋白酶维持液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）、不同H9N2亚型SIV（A/swine/HeBei/012/2008/（H9N2）接种剂量（1：10、1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000、1：1 000 000和1：10 000 000）及不同病毒吸附时间（0.5、1.0、2.0和3.0 h）条件下观察PMVEC形态变化,并测定细胞上清液中H9N2亚型SIV的HA滴度。在未加病毒的情况下,低于0.6 μg/mL的TPCK-胰蛋白酶对PMVEC的生长未造成任何影响,但随着TPCK-胰蛋白酶浓度的增加,PMVEC开始出现肿胀、变圆,甚至脱落;采用含有0.6 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液将H9N2亚型SIV稀释为不同的浓度感染PMVEC,在0.3 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液、10^-2病毒稀释倍数感染条件下48和72 h HA滴度分别为4.6log2和6.4log2;病毒吸附时间为2 h且中间震荡20 s的条件下H9N2 HA滴度最佳。结果表明,当TPCK-胰蛋白酶维持液浓度为0.3 μg/mL、病毒接种浓度为10^-2、吸附时间为2 h且中间震荡20 s时,H9N2亚型SIV在PMVEC中增殖最佳,达到6.8log2。     

钝叶瓦松带芽叶片的组织培养和快速繁殖

以钝叶瓦松（Orostachys malacophyllus）带芽叶片为外植体,MS为基本培养基添加不同质量浓度的6 BA、NAA和2,4 D,探讨了不同植物生长调节剂对钝叶瓦松带芽叶片启动的影响,以期筛选出最佳培养基配方,建立钝叶瓦松组织培养再生体系。结果表明,叶片腋芽最佳启动培养基为MS+6 BA 3 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1,腋芽增殖的最佳培养基为MS+6 BA 1.5 mg·L-1+2,4 D 0.2 mg·L-1,腋芽的增殖倍数为5.35。最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.3 mg·L-1,生根率为96.67%,移栽后成活率为76.67%。     

黄藤素对山羊子宫内膜上皮细胞的体外毒性研究

为了探究黄藤素的体外细胞毒性,采用不同浓度的黄藤素作用山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）后,采用MTT法绘制细胞生长曲线;倒置显微镜下观察细胞生长状态;瑞氏-姬姆萨染色法观察细胞形态学变化并通过测定乳酸脱氢酶（LDH）含量检测细胞膜的完整性。结果显示,当黄藤素的浓度为10~227 μg/mL时,黄藤素对EECs有促增殖的作用;当浓度大于227 μg/mL时出现细胞增殖抑制现象,药物对细胞的半数增殖抑制率（IC₅₀）为360 μg/mL;瑞氏-姬姆萨染色结果显示,100、200 μg/mL的黄藤素作用于EECs时均未对其细胞核、细胞浆的形态产生影响;LDH结果显示,药物浓度≥250 μg/mL时细胞LDH的释放量极显著高于正常细胞组（P<0.01）。综上所述,黄藤素作用于山羊EECs后呈现一定的毒性作用,且呈现显著的剂量依赖效应,作用于EECs的安全剂量范围为≤250 μg/mL。     

虫草素体外抗弓形虫的效果及其作用机制的探究

为探究虫草素抗弓形虫的效果及作用机制，本研究将不同浓度的虫草素与弓形虫RH株共同作用48 h后，采用CCK8法筛选对细胞安全的虫草素浓度。结果显示，以1μg/mL～200μg/mL (以对细胞的抑制率均为0判定)的虫草素为细胞的安全浓度。将巨噬细胞接种弓形虫RH-GFP株，同时分别加入1μg/mL～100μg/m L虫草素，根据弓形虫的荧光强度，计算虫草素对弓形虫的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果显示，虫草素对弓形虫的IC₅₀为31.24μg/mL，且其对弓形虫的抑制作用与虫草素的浓度呈正相关。将巨噬细胞接种弓形虫RH株，同时加入100μg/mL虫草素，2 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测并统计黏附与侵入细胞的弓形虫数量，分析虫草素对弓形虫黏附与侵入细胞的影响；24 h后采用吉姆萨染色后统计细胞感染率；收集上述各组细胞样品，一部分细胞采用q PCR检测细胞中弓形虫B1基因的转录水平，分析虫草素对弓形虫增殖的影响；一部分细胞采用IFA检测并统计每孔细胞100个空泡(PV)中的弓形虫速殖子的数量，分析虫草素对弓形虫复制水平的影响。结果显示，与...     

二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制

旨在用类金属毒性物质——砷对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的染毒试验，探索砷对绒山羊皮肤成纤维细胞毒性作用和其诱导细胞凋亡的机制，为后续研究砷对绒山羊皮肤细胞生长的影响提供理论依据。本研究随机选取1只7月龄各项机能正常，体重为25 kg左右的雄性辽宁新品系绒山羊，取其腹部皮肤，进行细胞培养。将二甲基砷酸药物配制成11个不同浓度组（0、0.1、0.2、0.4、0.8、1、5、10、25、50、100 mmol·L^-1），对细胞量为3×10⁴个·mL^-1皮肤细胞进行药物染毒24、48、72、96 h后，经MTT法进行3次重复试验，得到绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖与抑制情况以及后续试验所选用的时间点和4个浓度组（对照、促进、临界、半抑制浓度（IC₅₀）），进一步借助免疫荧光检测观察细胞骨架形态变化；彗星试验检测细胞DNA损伤情况；流式细胞仪检测细胞凋亡；透射电镜观察细胞质与细胞器的变化；测定细胞内荧光染料Mito-Tracker Green的染色强度分析线粒体跨膜电位（ΔΨm）以及观察分析溶酶体的数量情况。结果，24 h时不同浓度的OD值均能明显地反映出二甲基砷酸对绒山羊皮肤成纤维细胞的增殖和抑制趋势，而48、72、96 h时增殖作用逐渐减弱甚至消失，24 h时细胞增殖与抑制效果最佳，因此选取24 h时的对照组（未做任何处理）、促进浓度组（0.8 mmol·L^-1）、临界浓度组（1 mmol·L^-1）、IC₅₀浓度组（38.68 mmol·L^-1）进行后续的试验。24 h时，剂量范围0.1～1 mmol·L^-1的二甲基砷酸促进绒山羊皮肤成纤维细胞增殖，此阶段细胞骨架形态完整，细胞DNA未出现拖尾现象，凋亡率较小，线粒体数目增多，膜结构清晰，嵴致密，形态完整，膜电位升高，溶酶体数量增多；浓度大于1 mmol·L^-1的二甲基砷酸抑制绒山羊皮肤成纤维细胞生长，引起明显的细胞毒性（P<0.01），此时细胞骨架形态发生改变，DNA未出现拖尾现象，凋亡率显著上升，线粒体发生肿胀，形态不规则，嵴断裂溶解，膜电位降低，溶酶体数量减少。IC₅₀组细胞骨架形态差异很大，细胞DNA出现彗星尾，最多最明显（P<0.01），细胞凋亡数目明显增多，膜电位明显降低（P<0.01），溶酶体数量显著下降（P<0.01）。本研究探索了二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞的毒性作用以及诱导细胞凋亡的机制，表明一定浓度的二甲基砷酸对辽宁绒山羊皮肤成纤维细胞具有毒性作用，并具有进一步诱导细胞凋亡作用。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1细胞系上增殖工艺研究

试验旨在通过DF-1细胞增殖获得高效价的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）抗原。通过病毒接种量、收毒时间、接毒时间、温度和维持液血清浓度5个培养条件的筛选和优化,对IBDV BJQ902株在DF-1细胞上的增殖工艺进行了研究。结果表明,IBDV BJQ902株在DF-1细胞上最佳增殖条件为：在37℃条件下培养,接毒量在0.01%~0.1%之间,接种时间为细胞传代后生长48~72 h,维持液血清浓度为1%~2%,收毒时间为病毒接种后60~72 h。在此培养条件下增殖病毒毒价在10^8.3~10^8.7 TCID₅₀/0.1 mL之间。     

诺丽试管苗的耐盐性初探

本研究通过对诺丽（Morinda citrifolia Linn.）试管苗在不同NaCl浓度的培养基上进行增殖和生根培养,观察盐胁迫对其影响,并对诺丽试管苗的生长指标进行统计与分析。结果表明：随着盐浓度（0%～1%）的升高,诺丽试管苗的株高、发根数逐渐减少,而茎节数、叶片数、叶片大小在0.1%、0.3%盐浓度时高于对照。诺丽试管苗的半致死盐浓度为1%。     

细胞冻存保护剂二甲基亚砜的细胞毒作用

二甲基亚砜(DMSO)是目前最好的细胞冻存保护剂,但也是一种对细胞毒性很大的化学试剂。本研究结果表明,培养液中DMSO浓度为10％时,细胞生长抑制率近100％;1‰浓度时抑制率为35％;即使是0.04‰的浓度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。我们认为,培养液中残存的DMSO是冻存细胞复苏后出现细胞毒现象的主要原因。因此我们提出,冻存细胞时操作过程要迅速;细胞融化后务必洗涤,尽量去除DMSO,是减少其对细胞毒性作用、保证细胞尽快恢复生长增殖的关键步骤。     

四种中药体外抗弓形虫效果的比较

目的:通过黄芩、甘草、马齿苋、桦褐孔菌四种中药体外抗弓形虫效果的比较,探讨其体外抗弓形虫的效果。方法用弓形虫RH株的速殖子感染培养的非洲绿猴肾细胞(VERO),加受试药物,以蒿甲醚为阳性药物对照,在加药后的12h、24h、48h观察细胞和弓形虫的生长情况及形态。加药48h后,分离出虫体,台酚蓝染色,计数,判断药物作用效果。结果:黄芩、甘草体外可明显抑制弓形虫的生长和繁殖,作用效果与药物浓度呈正相关;而马齿苋及桦褐孔菌体外抑制弓形虫效果较弱。     

Use of a serum-free medium to produce in vitro Neospora caninum and Toxoplasma gondii tachyzoites on Vero cells

Neospora caninum and Toxoplasma gondii are cyst-forming coccidian parasites of human and veterinary clinical relevance. In vitro cultivation of the protozoans using Vero cells is usually performed in order to produce antigenic materials. Quantitative and qualitative comparisons of Vero cells grown in RPMI medium supplemented either with foetal calf serum (FCS), horse serum (HS) or a specific serum-free additive (DefCell) were performed. A serum-free cell culture system used to propagate N. caninum (NC-1 isolate) and T. gondii tachyzoites (Rh stain) were compared with the other two cell culture systems. FCS supplemented media was found to be more effective than the others in promoting Vero cells and N. caninum tachyzoites. However, it was found unable to support adequate T. gondii tachyzoite proliferation. Vero cells, T. gondii and N. caninum tachyzoite production gave similar growth patterns with either HS or DefCell supplemented media. Defcell was considered as a good alternative to supplement culture medium.     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM＋10%胎牛血清＋5%DMSO;B组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%DMSO;C组：75%DMEM＋10%胎牛血清＋15%DMSO;D组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%DMSO;E组：85%DMEM＋5%胎牛血清＋10%DMSO;F组：75%DMEM＋15%胎牛血清＋10%DMSO;G组：70%DMEM＋20%胎牛血清＋10%DMSO;H组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%甘油;I组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%甘油;J组：60%DMEM＋10%胎牛血清＋30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性（P〉0.05）;传代后B组细胞的生长状况最好。     

鸡睾丸生精上皮细胞冷冻保存研究

以广西土鸡为试验材料，利用两步酶解法从出壳后20～30日龄公鸡睾丸中获取生精上皮细胞，以含20％胎牛血清的DMEM为基础培养液，比较了不同浓度DMSO和蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响。结果表明：DMSO的最佳浓度为10％，添加蔗糖对冻存有害。以10％DMSO为防冻剂，复苏后生精上皮细胞原代混合培养可形成典型的精原干细胞集落，集落呈碱性磷酸酶（AKP）阳性，说明以10％DMSO为防冻剂的冷冻体系适合鸡睾丸生精上皮细胞的冷冻保存。     

Comparison of detection methods for Toxoplasma gondii in naturally and experimentally infected swine

Results from recent serological surveys and epidemiological studies show that pigs raised in a variety of management systems can be carriers of the tissue cyst stage of Toxoplasma gondi. This parasite can be transmitted to humans through the consumption of improperly prepared pork, making detection and removal of infected swine carcasses from the food chain an important food safety issue. Several methods are available for detection of T. gondii infected swine, including serological assays, polymerase chain reaction, and animal bioassays. The aim of the present study was to compare the detection sensitivities of six of these commonly used methods for detection of T. gondii infection in tissues from naturally and experimentally infected pigs. The results indicate that a serum-based ELISA is the most sensitive method, of those tested, for detection of T. gondii infected swine.     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

内蒙古部分地区放牧牛羊弓形虫血清学调查

[目的]了解内蒙古部分地区放牧牛羊弓形虫病感染情况。[方法]采用间接血凝试验(IHA)对阿拉善盟及呼伦贝尔市随机采集的286份放牧牛羊血清样本进行弓形虫抗体检测。[结果]绵羊血清弓形虫抗体总阳性率为1.68%,其中,阿拉善盟阳性率为4.84%,呼伦贝尔市阳性率为0.56%;经统计学分析,两个地区的绵羊血清弓形虫抗体阳性率差异不显著(P>0.05);牛血清弓形虫抗体总阳性率为0。[结论]内蒙古主要牧区放牧绵羊存在弓形虫感染,应引起足够的重视,并制定相应的弓形虫病防治措施。     

检测实验动物弓形虫感染的两种PCR方法的建立和比较

为了建立敏感、稳定、特异的PCR检测体系，用于实验动物弓形虫感染的检测。采用B1基因设计引物，建立常规PCR，用P30基因设计引物，建立巢式PCR；用两种PCR方法检测实验感染弓形虫小鼠血液和腹腔波中的DNA动态变化；用巢式PCR检测自然状态下的普通级豚鼠、教学和科研用兔的弓形虫感染率，并和常规PCR检到结果比较。结果，巢式PCR可检测到1fgDNA含量，比常规PCR敏感lOO倍；对其他微生物DNA无交叉现象，特异性强；对同一样品重复检测3次，阴、阳性结果一致，稳定性好。小鼠感染弓形虫2d后，巢式PCR对小民腹腔液的阳性检出率为83．3％，对血液的阳性检出率为33．3％；感染3d后，腹腔液阳性检出率为100％；而常规PCR在小鼠感染3d和4d后才能在腹腔液和血液中检测到，检出率各为16．7％。受检普通级豚鼠没有感染弓形虫，教学和科研用兔的弓形虫总感染率为14．3％。结论认为，巢式PCR方法可用于实验动物弓形虫早期感染的检测，具有敏感性高、特务性强、稳定性好的特点。     

屠宰羊弓形虫感染情况调查

为了保障羊肉制品的生物安全,对屠宰羊进行弓形虫感染情况调查以及对羊肉进行弓形虫检测。采用间接血凝试验,对677份屠宰羊的血清进行了弓形虫抗体检测。结果显示,弓形虫抗体阳性有47份,阳性率为6.9%。