深色有隔内生真菌S12菌株遗传转化体系的建立及GFP标记菌株的获得

【目的】建立深色有隔内生真菌（dark septate endophyte,DSE）的遗传转化体系,获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的DSE转化子,为研究DSE在植物根系的侵染定殖行为和侵染定殖规律奠定基础。【方法】以前期从健康枸杞根系分离的1株DSE菌株枝状枝孢菌（Cladosporium cladosporioides）S12菌株为供试材料,确定潮霉素B对其的最低抑制质量浓度,然后研究菌龄（13,15,17,19和21 h）、酶解时间（1.0,1.5,2.0,2.5,3.0和3.5 h）、崩溃酶质量浓度（10,15,20,25,30和35 mg/mL）和渗透压稳定剂种类（NaCl、KCl、CaCl2和MgSO4）对S12菌株原生质体制备的影响。采用聚乙二醇（PEG）介导原生质体转化法将PDL2质粒（含hph和gfp基因）转入S12菌株,对所获转化子进行表型、GFP荧光、PCR及拮抗活性（以尖孢镰刀菌枸杞专化型Fusarium oxysporum f. sp.Lycium barbarum LR-1菌株为靶标菌）检测,筛选与野生型S12菌株无明显差异且带有GFP标记的转化子。【结果】S12菌株在YPD液体培养基中培养17 h,以0.7 mol/L NaCl为稳渗剂,用30 mg/mL的崩溃酶酶解2.5 h,原生质体制备数量最多,为4.53×10⁶ mL^-1。通过PEG介导,将PDL2质粒（含hph和gfp基因）转入S12菌株,可得47株转化子,转化效率2.35株/μg,从中筛选出10株生长速度和产孢量与野生型S12菌株无明显差异的转化子。荧光观察、PCR和拮抗活性检测结果表明,外源基因已成功整合到S12菌株中,成功建立了S12菌株的遗传转化体系,并获得了GFP标记菌株,有6株转化子对LR-1菌株的抑菌率与野生型S12菌株无明显差异。【结论】成功建立了遗传稳定性良好的S12菌株遗传转化体系,筛选出了6株抑菌效果与野生型菌株相当的转化子。     

枸杞内生嗜线虫镰刀菌对灵武长枣采后致腐真菌的抑制作用

【目的】研究枸杞内生嗜线虫镰刀菌（Fusarium nematophilum）NQ8GⅡ4对灵武长枣致腐真菌的抑制作用和保鲜效果,为灵武长枣采后保鲜提供参考。【方法】以灵武长枣采后优势致腐真菌交链格孢（Alternaria alternata）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）为靶标菌,采用皿内对峙试验,设同时接种NQ8GⅡ4和靶标菌、接种NQ8GⅡ4 4 d后再接种靶标菌和接种靶标菌4 d后再接种NQ8GⅡ4 3个处理,测定NQ8GⅡ4的抑菌率;采用盖玻片对峙法培养NQ8GⅡ4和靶标菌,显微观察NQ8GⅡ4对靶标菌的拮抗作用。制备NQ8GⅡ4培养液,检测其对靶标菌丝生长（培养液体积分数为10%,15%,20%,25%,30%和40%）和孢子萌发（培养液体积分数10%,20%,30%,40%和50%）的抑制作用。采用皿内对峙法测定NQ8GⅡ4对米根霉（Rhizopus oryzae）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）和球派伦霉（Peyronellaea glomerata）的抑菌广谱性。采用平板对扣法测定NQ8GⅡ4挥发物质对靶标菌丝生长的抑制作用。将灵武长枣用NQ8GⅡ4培养液体积分数分别为10%,20%,30%,40%和50%的液体浸泡1 min后晾干,15 ℃冷藏,以无菌水浸泡处理为对照,每隔5 d观察腐烂情况并统计腐烂率,分析NQ8GⅡ4培养液对灵武长枣的保鲜作用。【结果】接种NQ8GⅡ4 4 d后再接种靶标菌处理的抑菌效果显著高于其他2个处理,该处理对交链格孢和灰葡萄孢的抑菌率分别达71.25%和68.75%。光学显微观察发现,菌株NQ8GⅡ4可使病原真菌菌丝出现畸形、干瘪和崩解等现象。菌株NQ8GⅡ4培养液对交链格孢和灰葡萄孢的菌丝抑制率分别为71.25%和62.00%;菌株NQ8GⅡ4培养液体积分数为50%时,对交链格孢和灰葡萄孢的分生孢子萌发抑制率分别达92.81%和88.72%。NQ8GⅡ4挥发物质对交链格孢和灰葡萄孢的抑菌率分别达94.34%和95.95%。菌株NQ8GⅡ4对出芽短梗霉、球派伦霉和米根霉抑制率分别达87.91%,75.42%和30.95%。在15 ℃贮藏条件下,体积分数20%的NQ8GⅡ4培养液处理30 d后,灵武长枣的腐烂率较对照处理下降了77.09%,货架期延长了15～30 d。【结论】枸杞内生嗜线虫镰刀菌NQ8GⅡ4是极具应用前景的果蔬保鲜剂出发菌种。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4定殖促生作用研究

为进一步明确内生生防菌NQ8GⅡ4在宿主和非宿主植物中的定殖能力和促生作用,采用生物学方法测定野生型NQ8GⅡ4菌株的促生潜力;利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的NQ8GⅡ4-GFP菌株,对枸杞、番茄、小麦、西葫芦、生菜和芹菜等6种植物进行灌根处理,利用激光扫描共聚焦显微镜观测NQ8GⅡ4-GFP菌株在宿主和非宿主植物中的定殖情况,同时检测不同接种浓度对枸杞苗生长的影响。结果表明,野生型NQ8GⅡ4菌株在5 d时赤霉素浓度可达16.6μg/mL,并具有一定解磷、产铁载体、纤维素酶和蛋白酶的能力。NQ8GⅡ4-GFP菌株能定殖于枸杞、番茄和小麦的根部,不能定殖于芹菜、生菜和西葫芦。不同植物定殖率有明显差异,在宿主植物枸杞根部定殖率最高,为93.9%,在非宿主植物番茄根部定殖率为91.84%,而在小麦根部定殖率仅为21.43%。不同接种浓度下对枸杞苗生长指标影响不同,其中以10⁵～10⁶ CFU/mL孢子液灌根,对枸杞苗促生作用显著,在农业上具有良好的应用前景。     

拟轮枝镰孢荧光标记与侵染结构观察

【目的】以玉米穗腐病优势病原菌和伏马毒素主要产毒菌拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）为研究对象,构建组成型表达绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白DsRED、过氧化物酶体靶向标记蛋白DsRED-PTS1和细胞骨架F-actin结合蛋白LifeAct-GFP的荧光菌株,观察拟轮枝镰孢侵染玉米须表皮的穿透结构,明确拟轮枝镰孢侵染结构形成的调控机制和影响因素。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化方法将荧光表达载体p COM-GFP、p COM-Ds RED、p COM-Ds RED-PTS1和p COM-Life Act-GFP分别导入拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2中,PCR鉴定含有目标基因的转化子,激光共聚焦显微镜观察各荧光蛋白的表达和分布;接种玉米须观察侵染结构;赛璐酚膜模拟植物表皮穿透试验,观察穿透结构和F-actin的动态组装;使用F-actin聚合抑制剂Latrunculin A、三环唑和活性氧抑制剂DPI(diphenyleneiodonium chloride)检测穿透结构形成的影响因素。【结果】建立了以遗传霉素G418为抗性标记的遗传转化方法;FV-GFP...     

以G418抗性为筛选标记的深绿木霉遗传转化研究

【目的】探索建立以G418抗性为筛选标记的农杆菌介导的深绿木霉遗传转化方法,为木霉菌突变菌株的筛选和基因功能研究奠定基础。【方法】测试供试野生型深绿木霉菌菌株T23对G418的敏感性,构建以G418抗性为筛选标记的质粒载体p1300-neo,并将该质粒通过农杆菌导入深绿木霉T23菌株中,利用G418抗性平板筛选获得转化子,通过PCR对稳定转化子进行鉴定。【结果】T23菌株对G418具有高度敏感性,25μg/mL G418可完全抑制T23菌株的生长;构建的p1300-neo载体是可行的G418抗性标记,通过该载体获得了多株具有G418抗性的深绿木霉遗传转化子。【结论】G418抗性可以作为深绿木霉菌有效的遗传筛选标记,其在PDA培养基中的使用量为25μg/mL。     

斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株,并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况,为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子,利用融合PCR融合克隆片段,构建Hac1i随机插入表达盒;再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列,融合克隆片段,构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体,通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子,荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒,利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株,经PCR初步验证,得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2~4d后,可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号,表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL~(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL~(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。     

绿色荧光蛋白基因标记芒果畸形病病原菌研究

芒果畸形病是世界性的芒果重要病害。采用PEG介导的原生质体转化法用绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(pCT74-sGFP)转化芒果畸形病病原菌(Fusarium proliferatum),获得了表达GFP的转化子。转化子经过单孢纯化后连续继代培养仍能发出稳定而强烈的荧光,通过GFP特异性引物PCR扩增转化子基因组获得预期片段,表明GFP基因已成功转入芒果畸形病病原菌基因组中且稳定遗传。GFP标记菌株生长正常,致病性和野生菌丝无差别。获得GFP标记的转化子,为应用发绿色荧光的芒果畸形病病原菌研究病原菌的侵染方式、扩展过程等奠定了基础。     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株原生质体制备及再生条件研究

以枸杞内生真菌Fusariumnematophilum NQG8Ⅱ4菌株为材料,利用单因素试验和响应面法对影响原生质体制备的4个因素(菌龄、酶解时间、酶质量浓度、稳渗剂浓度)进行优化,获得原生质体制备的最佳条件。确定酶解时间,酶质量浓度,稳渗剂浓度三因素对原生质体产量、原生质体再生率和有效原生质体量的组合效应。结果表明,NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件为:过滤收集菌龄16 h的菌丝0.05 g于1mL质量浓度为30.30 g/L崩溃酶+10 g/L溶壁酶的酶解液中反应2.5 h;以0.713 mol/L NaCl为稳渗剂,原生质体产量平均为7.12×10⁷ mL^-1,再生率平均为5.56%,有效原生质体量平均为39.59×10⁵mL^-1,与模型预测值拟合较好。获得枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件,为该菌株在原生质体诱变、基因组重排、基因编辑技术等后续分子遗传学研究提供理论基础。     

利用绿色荧光蛋白报告基因标记研究麦根腐平脐孺孢对小麦根和叶片的侵染

【目的】利用绿色荧光蛋白标记研究麦根腐平脐孺孢（Bipolaris sorokiniana,引起小麦根腐病和叶枯病）对小麦根系和叶片的侵染过程,建立直观、非破坏性研究病原菌-植物互作的体系。【方法】采用农杆菌介导法将gfp导入麦根腐平脐孺孢菌株Bs-1中,对转化子进行荧光表达、PCR验证、遗传稳定性、生长特性和胞外酶代谢分析。选用与野生型菌株表现相近的转化子Bs-GFP研究麦根腐平脐孺孢对小麦品种矮抗58根和叶片的侵染过程。【结果】转化子Bs-GFP的菌丝和分生孢子表达明亮的绿色荧光,利用基因特异标记扩增证明gfp被整合到真菌的基因组中。对GFP标记菌株Bs-GFP的遗传稳定性和生长特性分析表明,gfp在转化子中能稳定地遗传,菌落的生长速度和胞外酶代谢与野生型菌株相比没有显著差异。菌株Bs-GFP可以在小麦的地下和地上部分引起病症,而且与野生型菌株Bs-1在小麦植株根系和茎基部组织定殖的数量（即CFU值）相近。【结论】利用农杆菌介导方法获得表达绿色荧光的麦根腐平脐孺孢菌株可以直观地观察病原菌对寄主的侵染过程,研究结果有助于更好地解析麦根腐平脐孺孢与小麦以及其它禾谷类寄主之间的互作。     

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白基因标记

【目的】开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究,直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害,明确病原菌的致病过程,为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段。【方法】采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白(GFP)转化,并检测转化子的遗传稳定性。【结果】GFP基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达,转化子在蓝色光源激发下,菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光;转化子10次继代培养后菌落生长良好,菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光,对寄主植物的致病力也未发生改变,【结论】GFP基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在,并对其致病力没有影响。     

稻瘟菌糖原合成酶激酶MoGSK3功能探究

【目的】观测稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）糖原合成酶激酶基因MoGSK3敲除突变体表型,明确MoGSK3在稻瘟菌中的潜在生物学功能,为挖掘防治稻瘟菌新型药剂的潜在靶标提供参考。【方法】基于同源重组原理,用split-PCR方法获得稻瘟菌MoGSK3敲除突变体菌株,将MoGSK3基因克隆到pFL2载体上得到MoGSK3-C融合载体,并将其通过PEG介导的原生质体转化法导入MoGSK3突变体中得到回补菌株。培养观察野生型菌株Guy11、突变体菌株G3-9及回补菌株GC-1的菌落形态和生长状况,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测稻瘟菌产孢相关基因的表达量;观察稻瘟菌不同菌株的分生孢子形态,通过附着胞洋葱表皮穿透试验及接种水稻叶片,研究其致病力;通过KI-I-2染色对野生型菌株Guy11及突变体菌株G3-9分生孢子和附着胞中的糖原运输能力进行观测。【结果】稻瘟菌MoGSK3突变体存在多个表型缺陷,与野生型菌株Guy11相比,MoGSK3突变体菌株G3-9菌落直径显著变小,生长缓慢,产孢相关基因表达量下降且分生孢子出现末端伸长畸形的状态。MoGSK3基因缺失还会导致稻瘟菌菌丝末端无法形成正常的分生孢子梗,附着胞无法穿透洋葱表皮形成侵染菌丝,接种划伤水稻叶片也无法形成褐色病斑。对MoGSK3突变体菌株G3-9分生孢子及附着胞进行糖原染色后发现,突变体菌株G3-9在糖原转运能力方面存在明显缺陷。【结论】MoGSK3基因参与稻瘟菌的生长、分生孢子形成及形态建成、侵染、糖原转运等过程,是稻瘟菌重要的毒力因子。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

利用转基因番茄表达人成纤维细胞生长因子21(FGF21)

【目的】在番茄中表达人成纤维细胞生长因子-21（Fibroblast growth factor-21,FGF21）,为利用植物反应器规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以甘露糖-6-磷酸异构酶基因（pmi）作为转基因植物的选择标记,将人源fgf21基因克隆至表达载体pCAMBIA1390RⅡ（简写为p1390RⅡ）上,构建重组表达质粒p1390 RⅡMFGF21。采用冻融法将质粒p1390RⅡMFGF21转入根瘤农杆菌EHA105,叶盘法转化番茄(Lycopersicon esculentum)“中蔬6号”,采用PCR检测、Southern杂交筛选转基因番茄阳性植株,并对FGF21蛋白在转基因番茄叶片中的表达进行了Western blot分析。【结果】成功构建了带pmi安全选择标记基因的植物双元表达载体p1390RⅡMFGF21,在番茄中初步建立了以pmi为选择标记基因的遗传转化体系,共获得了26株转基因番茄植株,其中5株为阳性克隆,转化率为19.2%。采用PCR扩增和Southern blot分析进行检测,结果表明,重组fgf21基因已整合到转基因番茄基因组中。Western blot分析检测结果显示,FGF21蛋白在转基因番茄叶片中有一定水平的表达,并具有良好的抗原性。【结论】获得了以pmi为选择标记成功表达FGF21蛋白的转基因番茄遗传体系。     

黑曲霉分泌表达载体的构建以及绿色荧光蛋白的表达

采用PCR扩增得到糖化酶基因启动子（PglaA-g）、色氨酸合成酶基因终止子（TtrpC）和潮霉素抗性筛选标记基因,依次连接这些基因元件,获得黑曲 Aspergillus niger 分泌表达载体pPHT. EGFP 基因与黑曲霉表达载体pPHT连接,得到重组表达载体pPHT-EGFP.pPHT-EGFP表达载体通过原生质体转化法转化黑曲霉,经潮霉素抗性筛选、基因组PCR鉴定阳性重组转化子.荧光显微镜观察表明,绿色荧光蛋白成功表达,而且荧光的分布具有一定的规律,主要集中在菌丝顶端、膈膜以及培养基中;固体培养基发出绿色荧光,表明绿色荧光蛋白分泌到培养基中,属于分泌性表达,蛋白分泌的部位主要位于菌丝顶端.     

拟南芥乙烯应答基因HLS1的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备乙烯应答基因HLS1多克隆抗体,在过表达植物中检测HLS1的积累,为深入研究HLS1响应乙烯信号通路的分子机制奠定基础。【方法】构建pET28a-HLS1c原核表达载体,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导获得重组蛋白HLS1c-His;镍柱亲和纯化重组蛋白后免疫家兔获得抗HLS1血清,利用抗原亲和纯化抗血清获得高纯度的HLS1多克隆抗体;用HLS1抗体和GFP抗体,检测原生质体瞬时转化体系中GFP-HLS1c融合蛋白的表达;用农杆菌蘸花法获得过表达GFP-HLS1g的转基因植物,用HLS1抗体和GFP抗体检测GFP-HLS1g融合蛋白的表达。【结果】成功构建了原核表达载体pET28a-HLS1c,并在大肠杆菌系统中诱导获得重组蛋白HLS1c-His,且多以包涵体形式存在。纯化的HLS1c-His多克隆抗体,能清晰检测到约80 ng原核表达的HLS1抗原。纯化的HLS1抗体不仅能检测到原生质体中瞬时表达的GFP-HLS1c融合蛋白,也能检测到过表达转基因植物株系中的GFP-HLS1g融合蛋白,并且与标签蛋白GFP对应抗体所检测到的特异性条带大小一致。【结论】成功制备了拟南芥HLS1蛋白多克隆抗体,为HLS1蛋白在植物发育中的功能研究奠定了基础。     

聚乙二醇介导咖啡炭疽菌遗传转化体系的建立

[目的]建立高效制备咖啡炭疽菌原生质体及聚乙二醇(PEG)介导的遗传转化体系的方法,为开展咖啡炭疽菌的致病分子机理研究打下基础.[方法]以咖啡炭疽菌野生型菌株BSC2-2为试验材料,通过PEG介导原生质体转化法将含有氯嘧磺隆标记和绿色荧光蛋白报告基因(GFP)的质粒pCB1532-G转入BSC2-2原生质体中,对获得的转化子进行遗传稳定检测、PCR分子检测和激光共聚焦显微观察.[结果]BSC2-2对氯嘧磺隆的耐受浓度为200.0 mg/L.最佳遗传转化体系为:28℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌丝2 h,收集原生质体,再经MTC缓冲液冲洗重悬后将质粒pCB1532-G转入原生质体,在RM培养基中混匀再生,获得转化子.GFP基因的PCR扩增和分生孢子荧光观察结果表明,GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中.转化子与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病力上无明显差别,表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因组中稳定遗传.[结论]成功建立了PEG介导的咖啡炭疽菌遗传转化体系,获得与野生型菌株在菌落形态、生长速率及致病性上无明显差别的转化子,为后续研究咖啡炭疽菌的基因功能和致病机理提供技术支持.     

西瓜尖孢镰刀菌FOV-135的绿色荧光蛋白基因转化

建立并优化了PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将绿色荧光蛋白基因转入到西瓜尖孢镰刀菌FOV-135菌株中.转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,每微克质粒DNA可获得4～6个性状稳定的转化子.PCR验证也表明gfp基因已转入到菌株FOV-135中.     

生防菌枯草芽孢杆菌CQBS03的绿色荧光蛋白基因标记及其在柑橘叶片上的定殖

【目的】利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因标记枯草芽孢杆菌生防菌株CQBS03,以研究其在柑橘叶片上的定殖规律。【方法】采用重叠PCR方法将p43启动子和gfp进行融合,并与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pHY300PLK连接构建重组质粒pHY43G,以重组质粒电脉冲转化生防菌株CQBS03,培养后于荧光显微镜下观察并通过SDS-PAGE分析工程菌株GFP的表达情况,然后进行工程菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用叶片喷雾方法接种,平皿稀释分离培养方法测定CQBS03-pHY43G在柑橘叶片上的定殖情况。【结果】重组菌CQBS03-pHY43G高效表达GFP,电泳后出现约29kDa的特异蛋白条带,外源质粒对宿主菌的生长未带来明显不利影响,质粒稳定性实验表明重组质粒pHY43G经30次传代后的稳定性为55%,室内平板抑菌实验结果显示CQBS03-pHY43G对柑橘溃疡病菌生防效果与出发菌株没有明显差异(P0.01),CQBS03-pHY43G菌株在叶片喷雾接种后的0—15d,在柑橘叶片上的数量呈现急剧下降趋势,15d后下降速度稍缓,最后保持相对稳定的较低水平(1.73×103cfu·g-1)。【结论】成功地将gfp转入野生型枯草芽孢杆菌生防菌CQBS03中,构建了荧光标记菌株,初步明确了生防菌的定殖规律。     

拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件优化

[目的]优化拮抗木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件,快速、高效获得绿色荧光标记菌株,为哈茨木霉及同类真菌的GFP标记提供参考,并为下一步研究其在不同环境中的定殖动态、分布规律及生防特性等打下基础.[方法]采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,从木霉菌株的菌龄、酶解时间、转化体系中质粒的含量及再生培养基中潮霉素B(HmB)的浓度等方面对哈茨木霉gz-2菌株原生质体制备及转化条件进行优化,获得表达稳定的转化子,并与出发菌株的生长特性进行比较,评价转化效果.[结果]gz-2菌株培养36 h菌丝所形成的原生质体稳定性最好,菌丝体酶解3.5 h获得的原生质体数量最多,达11.67×106个/mL;每240μL转化体系中质粒DNA含量为40μL,得到的转化子数量最多,为8.67个/皿;再生培养基中HmB含量为600μg/mL时可获得稳定的强转化子.[结论]筛选获得1株表达稳定的转化子GFP-gz-2菌株,该菌株在菌落形态、菌丝生长速率及产孢量上与出发菌株gz-2无显著差异,且具有较好的遗传稳定性.