紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因PfJMT的克隆及表达分析

【目的】茉莉酸羟基甲基转移酶（jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT）是植物茉莉酸甲酯生物合成的关键酶,通过克隆紫苏JMT,并研究其在不同胁迫下和种子不同发育时期的表达模式,为研究JMT在植物防御和种子发育中的作用提供理论依据。【方法】根据紫苏种子转录组测序结果设计引物,从紫苏中克隆得到紫苏茉莉酸羟基甲基转移酶基因的DNA和cDNA序列,命名为PfJMT,通过生物信息学分析该基因的结构、稳定性、亲水性、亚细胞定位及保守结构域等,利用系统进化树分析PfJMT和其他物种JMT蛋白的进化关系。取开花期的紫苏根、茎、叶、花等组织用于组织特异性表达分析。取开花后5、10、15、20、25和30 d的种子用于JMT在种子不同发育时期表达模式的研究。用25 μmol·L ^-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和1 mmol·L ^-1水杨酸（salicylic acid,SA）喷洒处理具有4片真叶的紫苏幼苗并浇灌根部,分别于处理0、2、4、8、16、24和48 h后取样,研究JMT在不同胁迫下的表达模式。 【结果】PfJMT的ORF长1 050 bp,编码349个氨基酸。生物信息学分析表明,PfJMT为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位于细胞质,含有一个甲基转移酶-7（Methyltransf-7）保守结构域。通过与其他物种的JMT蛋白多序列比对发现,紫苏JMT和丹参JMT的序列一致度最高,为80.5%,和水稻的序列一致度最低,为36.8%。在对多种不同植物基于JMT蛋白构建系统进化树的分析中发现紫苏和拟南芥、丹参等双子叶植物亲缘关系较近,而与建兰、水稻等单子叶植物亲缘关系较远,说明JMT在单子叶和双子叶植物的进化过程中可能存在较大的差异。荧光定量PCR结果表明,PfJMT在紫苏根和茎中的相对表达量最低,叶和花中的相对表达量比根和茎中略高,在开花后5d的种子中的表达量最高,并且随着种子的发育表达逐渐下调,说明JMT在种子发育中起着重要作用。在使用外源MeJA和SA处理的紫苏根、叶组织中,PfJMT表达均显著下调,这一结果支持JMT可能不直接参与防御反应,而是通过调节JA水平间接参与植物防御的理论。【结论】成功克隆获得PfJMT,随着种子的发育PfJMT表达量逐渐下调,并在外源MeJA、SA胁迫下表达量显著下调。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。     

紫苏12个农艺性状与产量的灰色关联分析

应用灰色关联分析法对11份紫苏材料的12个农艺性状与产量的关联度进行了分析.结果表明:12个性状和产量之间的关联度由大到小依次为单株产量、千粒质量、分枝位、二次有效分枝、一级分枝顶穗长、一次有效分枝、株高、顶部第1节间长、茎粗、主花序有效长度、基部第1节间长、主花序有效角果数.因此,紫苏高产育种中应注意单株产量以及大粒型、多分枝、长穗型植株的选育.     

紫苏叶提取物活性成分测定分析

[目的]研究紫苏叶活性成分含量.[方法]采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定紫苏叶提取物粉总黄酮含量;采用苯酚-硫酸比色法测定紫苏叶提取物粉多糖含量.[结果]紫苏叶提取物粉总黄酮含量为32.51％,多糖含量为9.43％.[结论]紫苏叶含多种活性物质,且紫苏叶中总黄酮含量和多糖含量都较高,这为进一步研究紫苏叶中其他活性物质奠定基础,也为紫苏叶产品进一步开发提供科学依据.     

紫苏组织培养与快速繁殖

以栽培紫苏为材料,通过对其离体茎段的组织培养,建立了诱导、分化、增殖、生根等一整套离体快繁体系。研究结果表明,紫苏茎段外植体较好的灭菌方法为:75%酒精30s+0.1%HgCl210min;茎段外植体初代培养的适宜培养基为MS+2mg.L-1 6-BA+0.5mg.L-1 NAA;继代及增殖培养以6-BA 2mg.L-1与NAA0.1mg.L-1配比时效果较好;试管苗生根培养的最适宜培养基是1/2MS基本培养基附加0.2mg.L-1 NAA。     

不同产地紫苏叶HPLC指纹图谱研究

为建立紫苏叶HPLC指纹图谱检测方法,采用HPLC法,以UltimateTMXB-C18（4.6mm×250mm,5μm）为色谱柱,乙腈（A）-0.1%乙酸（B）为流动相进行线性梯度洗脱,在330nm波长下以迷迭香酸为参照物测定了9个不同产地的紫苏叶的指纹图谱,并作相似度比较分析。建立了紫苏叶HPLC指纹图谱共有模式,...     

茉莉酸羧基甲基转移酶基因的克隆及其高效表达载体的构建

以拟南芥花为材料,应用RT-PCR方法克隆拟南芥茉莉酸甲酯合成途径中重要的限速酶--茉莉酸羧基甲基转移酶基因,并进行生物信息学分析,以pCAMBIA1304+为基本载体构建其植物高效表达载体pCAM-BIA1304-AtJMT克隆到的AtJMT编码区序列为1 170 bp,编码389个氨基酸的多肽.生物信息学分析该蛋白理论分子量为43.37 kD,等电点为5.18.三级结构预测表明其具有典型的羧基甲基转移酶蛋白功能域甲基供体的结合位点,蛋白质三维模型具有典型的甲基转移酶的蛋白立体结构.获得的工程菌可用于遗传转化长春花等,为萜类吲哚生物碱代谢工程新型策略奠定基础.

Abstract：

Jasmonic acid carboxyl methyltransferase (JMT) is one of the most important key enzymes involved in the biosynthetic pathway of methyl jasmonate (MeJA) in Arabidopsis thaliana. The JMT gene of A. thaliana (AtJMT) was isolated through RT-PCR with a pair of specific primers that were designed according to the sequences of the JMT reported. We characterized it by bioinformatic analysis and constructed its over-expression vector. The computational analysis of the coding sequence showed that it had 1170 bp nucleic acids, encoding 389 amino acids (aa) polypeptide with a predicted molecular weight of 43. 37kD and an isoelectric point of 5.18. Bioinformatic analysis demonstrated that AtJMT contained the typical functional domains of JMT, methyl donor binding sites. The 3-D structure of AtJMT had the typical structure of known methyltransferase protein. The engineered bacteria can be used to genetically transform Catharanthus roseus, to promote the bioaccumulation of TIAS. The cloning, characterization and construction of plant expression vector will be a fundamental work to facilitate new strategies of the metabolic engineering of TIAS.     

不同变种及种源紫苏种子油脂肪酸组成及含量比较

采用化学萃取和GC-MS法,对5个变种11个种源地的17个种质的紫苏种子样品开展了种子油含量及其脂肪酸组成和相对含量的比较和分析。GC-MS结果表明,紫苏油中共发现14种脂肪酸,按相对含量高低划分为6种高含量脂肪酸(＞0.8%)和8种低含量脂肪酸(≤0.2%);其中14-甲基-十六烷酸(C17∶0)、十八碳二烯酸(C18∶2n3)、二十三碳酸(C23∶0)3种低含量脂肪酸为首次在紫苏油脂中被报道;高含量脂肪酸中α-亚麻酸的相对含量最高,达51.92%~62.98%;α-亚麻酸、亚油酸与油酸之间存在一定代谢转化相关性。脂肪酸含量外标法计算结果表明,5个变种中白苏变种的含油率和α-亚麻酸含量较高,作为紫苏油生产原料具有一定优势。      

不同品种(系)紫苏含油量及脂肪酸成分对海拔的响应

为紫苏的合理栽培提供理论依据,在贵州选取5个海拔梯度(398~1 391m)试验点种植6个紫苏品种(系)(奇苏1~6号),收获后检测紫苏含油量及主要脂肪酸成分,分析不同海拔高度紫苏含油量及脂肪酸成分变化。结果表明:不同品种(系)紫苏含油量及脂肪酸成分对不同海拔试验点的响应不同,奇苏1号在镇宁县(海拔1 391m)、开阳县(615m)、思南县(398m)和福泉市(821m)以及奇苏4号在开阳县试验点含油量较高,平均含油量47.27%;奇苏4号在开阳县、湄潭县(海拔802m)、思南县和镇宁县以及奇苏3号在开阳县种植的α-亚麻酸含量较高,平均含量为65.03%;奇苏1号、奇苏2号、奇苏4号和奇苏6号在镇宁县种植及奇苏3号和奇苏5号在福泉市种植的籽粒不饱和脂肪酸含量较高。以含油量为目标性状,奇苏1号含量较高,适宜贵州省内不同海拔点种植;若以亚麻酸含量为目标性状,奇苏4号含量较高,适宜贵州省内不同海拔点种植;以不饱和脂肪酸为目标性状,偏高海拔地区种植紫苏其籽粒不饱和脂肪酸含量较高。     

紫苏子叶组织培养植株再生的研究

[目的]以紫苏无菌苗子叶为外植体研究紫苏芽再生频率。[方法]在MS培养基中添加不同浓度配比的6-BA和IAA,给予不同黑暗培养时间2、4,-D浓度和预培养时间,研究各因素对紫苏芽苗分化的影响。[结果]子叶在分化培养基MS＋1.0 mg/L 6-BA＋1.5mg/L IAA中培养可获得高达80.01%的再生频率0,.10 mg/L 24,-D的分化培养基预培养3 d,黑暗培养12 d后再转入光照培养效果最好。[结论]该试验可为紫苏的组培繁殖提供参考。     

不同时间低温处理对紫苏抗逆性的影响

[目的]研究低温处理对紫苏抗逆性生理指标的影响,确定紫苏所能承受的低温时间。[方法]以无病虫害的紫苏自顶端第5~8片叶为试材,分别进行0(对照)、12、24、36、48和60 h的低温处理,对其脯氨酸、丙二醛含量以及电导率进行测定与分析。[结果]不同低温处理时间下紫苏叶片的抗逆性生理指标存在明显差异。紫苏叶片的丙二醛含量和电导率均随低温处理时间的延长而逐步上升;低温处理12 h后,叶片脯氨酸含量达到最大值,低温处理12~60 h,脯氨酸含量逐渐减少。[结论]紫苏所能承受的低温处理时间不超过48 h,低温处理12 h时其抗逆性最强。     

白苏乙醇提取物及挥发油抑菌活性研究

分别采用溶剂浸提和水蒸汽蒸馏法对白苏叶进行提取,并用生长速率法分别测定2种白苏叶提取物对7种植物病原真菌的抑制作用。测定结果表明,在0.1 g干样/mL下,白苏叶乙醇提取物在3~5 d的培养时间内能够完全抑制辣椒疫霉病菌的生长,对番茄灰霉病菌的生长抑制率高于60%。白苏叶挥发油在测定中对植物病原真菌也表现出较强的抑菌活性。白苏叶挥发油在0.5 mg/mL时能够完全抑制供试7种供试病菌的生长。白苏挥发油对7种供试植物病原真菌的测定表明,挥发油对水稻纹枯病菌和番茄灰霉病菌具有较强的抑制作用,EC50分别为0.0677mg/mL和0.1050 mg/mL。     

贵州紫苏叶中氨基酸及游离氨基酸含量分析

采用L-8800氨基酸分析仪对奇苏II、奇苏III、M183和M218四个贵州本地紫苏品种叶片中总氨基酸及游离氨基酸进行测定。结果表明,四个品种的贵州紫苏叶中总氨基酸含量有显著差异,最高为奇苏II,鲜叶含量为8.02 g/100g;游离氨基酸中奇苏III与M183两个品种均检出17种游离氨基酸,奇苏II与M218共检出16种及15种游离氨基酸,四个品种紫苏叶游离氨基酸含量在0.25~0.31 g/100g之间。结果还表明,四种贵州紫苏叶中氨基酸EAA/TAA、EAA/NEAA值接近WHO/FHO参考标准,药效氨基酸比例高达60%以上,具有较高的营养价值和保健作用,是有利于人体氨基酸营养平衡的植物氨基酸资源。     

紫苏开花期花粉的活力及柱头可授性

为紫苏杂交育种提供参考,对紫苏的开花期(花蕾期、初开期、盛开期、凋谢期)进行定位观测,采用醋酸洋红染色法和联苯胺-过氧化氢法对紫苏的花粉活力和柱头可授性进行测定。结果表明:花前6h的花粉活力最高,为82.76%;柱头在花前6h至花后3h内具有较高的可授性。     

212份紫苏属植物资源的表型性状及抗性鉴定与聚类分析

为紫苏属植物种群划分及育种利用提供参考,采用田间试验观察212份紫苏属植物资源的表型性状及抗逆性,并依据21个表型性状对其进行聚类分析。结果表明:1)212份紫苏属植物资源的叶色、叶形、花色、苞叶及种子等性状差异明显。2)在212份紫苏属植物资源中,抗倒性较强的材料占91.98%,抗虫性较强的为2.83%,抗锈病极强的为1.89%,抗白粉病强的为4.25%,抗根腐病较强的为3.77%。3)聚类分析将212份紫苏属植物资源分为紫苏(原变种,Perilla frutescens var.frutescens)和回回苏(P.frutescens var.crispa)2类群。抗倒性、抗虫性、抗病性较强的紫苏属植物资源可作为抗性育种材料利用或直接用于大田生产。     

紫苏不同品种的生产比较试验

为促进紫苏新品种选育及推广,在贵州省不同区域对4个紫苏新品(系)进行生产试验,比较不同品种(系)的产量、生育期、农艺学性状、品质性状及抗性表现。结果表明:与当地农家种(CK)相比,参试各品种(系)生育期提早2.6~9.5d,增产16.77~23.88kg/667m2,含油量提高1.28~7.77百分点。各品种/系中,5号的产量最高,生育期最短,a-亚麻酸含量最高,品质及其他农艺学性状均较好,表现优良;2号的含油量高达49.01%,可作为高油紫苏新品系进行培育。     

云南紫苏的种子DNA提取和RAPD引物筛选

 以保存多年的云南紫苏种子为材料,对其DNA提取和RAPD引物筛选进行了研究。结果表明:从活力很低的紫苏种子提取的DNA也有较高的质量,可以用于RAPD分析;从86个随机引物中筛选出了42个显示紫苏遗传差异的多态性引物。     

紫苏粕中类胡萝卜素提取工艺参数的优化

为提高紫苏粕的综合利用率,采用有机溶剂提取法提取紫苏粕中的天然类胡萝卜素,通过单因素试验得出适宜的提取溶剂种类、丙酮与甲醇的体积比、提取温度、提取时间、固液比(紫苏粕质量与混合液体积的比),通过正交试验得出有机溶剂提取紫苏粕中类胡萝卜素的最佳工艺条件:丙酮与甲醇体积比为2:1,提取温度为50℃,提取时间为8h,固液比为...     

紫苏属植物的研究进展及发展潜力

紫苏是我国传统的特色药食两用型油料作物,在医药、食品、油料及景观方面具有重要应用价值。为紫苏的进一步深入研究提供参考,从紫苏的主要成分、药食价值、资源分布、栽培区域及品种选育进展进行综述,分析紫苏种群划分以及关键性状分子机制的研究进展,并对我国紫苏研究中存在的问题进行分析讨论,对紫苏的下一步研究方向提出展望。     

基于SSR标记13个紫苏品种(系)的亲缘关系及遗传多样性

为紫苏种质资源利用提供参考,利用14对SSR引物对13个紫苏品种(系)提取的DNA进行PCR扩增,并对其亲缘关系进行鉴定与遗传多样性分析。结果表明:1)从13个紫苏品种(系)中共检测出51条清晰DNA条带,其中多态性条带47条,占92.16%。2)13个紫苏品种(系)的遗传距离为0.086~0.576,平均遗传距离为0.336;遗传相似性系数为0.424~0.914,平均遗传相似性系数为0.654。3)在遗传距离(SM)为0.59时,13个紫苏品种(系)可聚为2类群。类群Ⅰ为开阳紫苏(CK)1个品种(系),类群Ⅱ包括奇苏1~6号及其原种1~6号共12个品种(系)。在SM为0.67时,类群Ⅱ又可分为2部分,第1部分包括奇苏1号和奇苏6号及其原种1号和原种6号共4个品种(系);第2部分包含奇苏2~5号及其原种2~5号共8个品种(系)。在SM为0.80时,原种2号、原种3号和原种4号的亲缘关系最近,但经系选改良后,其亲缘关系已有一定距离。