油酸和亚油酸对山羊乳腺细胞甘油三酯含量及乳脂合成相关基因表达的影响

为探讨外源添加油酸和亚油酸对体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯(TG)含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响,试验以奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,分别用0、50、100、200μmol/L油酸和0、20、40、80μmol/L的亚油酸处理细胞24h,检测细胞内TG的含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞内乳脂合成相关基因mRNA水平的变化。结果显示,100、200μmol/L的油酸和40、80μmol/L亚油酸均显著促进细胞内TG的合成(P0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,添加100、200μmol/L油酸可显著上调二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)及脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达(P0.05),显著抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因的表达(P0.05),而对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因的表达无显著影响(P0.05)。添加20μmol/L亚油酸可显著抑制ACC和FASN基因的表达(P0.05);亚油酸浓度为40和80μmol/L时可显著上调DGAT2基因的表达(P0.05),抑制SCD1和SREBP1基因的表达(P0.05),对ACC、FASN和PPARγ基因表达均无显著影响(P0.05)。综上所述,100～200μmol/L油酸和40～80μmol/L亚油酸对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂肪合成具有较好的促进效果。     

bta-miR-29d-3p对奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量的影响

为探索bta-miR-29d-3p与奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量之间的调控关系,试验设计并合成bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物,通过瞬时转染技术将bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物转染到奶牛乳腺上皮细胞中,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测bta-miR-29d-3p抑制或过表达后奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因表达水平的变化,细胞内甘油三酯含量用试剂盒检测。结果显示：bta-miR-29d-3p过表达后甘油三酯合成相关基因二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAM）,脂肪酸合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)、脂肪酸合成酶（FASN）,转录因子固醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)的表达量显著降低（P <0.01）,肝X受体Α（LXRA）表达量显著上升（P <0.01）。同时过表达bta-miR-29d-3p奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量显著降低（P <0.05）。干扰bta-miR-29d-3p显著增加了DGAT1、ACACA、FASN、GPAM、转录因子过氧化物酶体...     

催乳素对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在探讨催乳素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛BMECs为试验材料,经纯化培养后,培养基中添加不同浓度催乳素[0(对照)、100、300、500和1 000 ng/m L],继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量;采用实时定量PCR法检测乳脂和乳蛋白合成相关基因的表达。结果表明:1)催乳素浓度为100、300 ng/m L时,BMECs相对增殖率显著高于对照组与其他试验组(P0.05)。2)与对照组相比,300 ng/m L催乳素能够显著提高BM ECs乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、二酰甘油酰基转移酶(DG AT)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)基因表达量及甘油三酯的含量(P0.05),硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因表达量有增加的趋势。3)与对照组相比,100、300 ng/m L催乳素能够显著提高哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、催乳素受体(PRLR)基因表达量(P0.05);300 ng/m L催乳素能显著提高αS1酪蛋白(CSN1 S1)基因表达量(P0.05)。综上所述,100~300 ng/m L的催乳素对BM ECs乳脂和乳蛋白合成有较好的促进效果。     

干扰CREB基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响

旨在筛选奶山羊cAMP应答元件结合蛋白CREB（cAMP response element binding protein）基因的siRNA,揭示干扰该基因后对乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响。本研究通过qRT-PCR方法从西农萨能奶山羊乳腺组织中扩增CREB基因完整的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期表达水平分析,合成靶向CREB基因的siRNA,利用荧光定量PCR筛选有效siRNA,并检测脂质合成相关基因的表达,采用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明：1）克隆得到全长为984 bp的奶山羊CREB基因的CDS区（GenBank登录号：MK158073）,并对其进行生物信息学分析。2）该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织的表达量为干奶期的1.93倍（P<0.05）。3）成功筛选到靶向CREB基因的有效siRNA,干扰效率为72%（P<0.01）;并将其在奶山羊乳腺上皮细胞进行转染,通过qRT-PCR检测脂质合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰CREB基因后显著抑制了FASN、ACACA、SCD1、FABP3、LPL、CPT1B、GPAM和DGAT2基因表达量（P<0.05）,并显著增加了HSL基因表达量（P<0.05）;且细胞内甘油三酯含量被显著下调（P<0.05）。综上所述,CREB基因在奶山羊原代乳腺上皮细胞中很可能通过调控脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量对山羊的乳脂合成过程发挥重要作用。     

不同功能性油脂对乳腺上皮细胞乳脂合成基因表达的影响

通过将不同种类功能性油脂(亚麻籽油、油茶籽油以及菜籽油)添加到乳腺上皮细胞中,研究其对奶牛乳腺上皮细胞中SREBP基因相关信号通路表达的影响。试验选用奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)进行体外培养,然后在分化培养基中分别添加相同浓度的不同功能性油脂,利用实时荧光定量PCR方法检测其对甘油三酯合成基因(LPL、AGPAT3)、活化和转运基因(FASN、ACACA、SCD)表达的影响;检测其对脂肪酸网络调控基因(SREBP1C、PPARγ)表达的影响。结果表明,油茶籽油能促进ACACA、SREBP1C、FASN、AGPAT3以及SCD基因的表达,抑制PPARγ基因的表达;亚麻籽油和菜籽油对乳脂合成的相关基因基本没有促进作用,但是3种不同种类的功能性油脂均可以抑制PPARγ基因的表达。     

油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响

本试验旨在探讨油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为试验材料,经纯化培养后,培养基中添加0(对照)、50、100、200、400μmol/L油酸,继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量;采用实时定量PCR法检测乳脂肪合成相关基因的表达。结果表明:油酸浓度为200、400μmol/L时,BMECs相对增殖率显著低于对照组与其他试验组(P0.05);添加100、200μmol/L的油酸促进了胞内甘油三酯的合成(P0.05);添加油酸上调了二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因表达量,50μmol/L的油酸显著上调了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARGγ)基因表达量(P0.05),100~400μmol/L的油酸显著抑制了硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、固醇调节原件结合蛋白1(SREBP-1)基因表达量。综上所述,50~100μmol/L的油酸对BMECs乳脂肪合成具有较好的促进效果。     

CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成相关酶的影响

为了研究体外添加c9,t11共轭亚油酸(CLA)和t10,c12 CLA对奶牛乳腺细胞(BMECs)中脂肪酸(FA)合成关键酶基因mRNA转录和SCD酶指数的影响,试验采用组织块分离培养BMECs,两种CLA浓度分别为0,50,100,150μmol/L,作用细胞24 h后采用荧光定量PCR(QRT-PCR)对目的基因进行相对定量。结果表明:与对照组相比,50μmol/L c9,t11 CLA显著抑制BMECs中的ACC、FAS、D5和D6基因mRNA,但150μmol/L却显著促进;50μmol/L t10,c12 CLA显著上调了ACC、SCD5、D5和D6基因的mRNA转录水平,对FAS转录无影响(P>0.05),但150μmol/L显著受到抑制;CLA均抑制SCD1的转录,促进SCD5转录。C9,t11 CLA使SCD酶指数显著增加,t10,c12 CLA则相反。     

脂肪酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂合成相关基因表达量的影响

本试验旨在探寻促进奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳蛋白和乳脂合成的短链脂肪酸(乙酸、β-羟丁酸)和长链脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸)的组合添加模式,为调控乳成分合成提供理论依据。BMECs经分离、纯化后,选取第2代细胞,分为5组,对照组不添加脂肪酸,Ⅰ组和Ⅱ组添加的乙酸、β-羟丁酸浓度比例均为2.0(9.60 mmol/L)∶1.0(4.80 mmol/L),油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例分别为2.0(17.30μmol/L)∶13.3(115.05μmol/L)∶1.0(8.65μmol/L)和9.6(75.20μmol/L)∶7.4(58.00μmol/L)∶1.0(7.80μmol/L);Ⅲ组和Ⅳ组添加的乙酸、β-羟丁酸的浓度比例均为1.0(7.20 mmol/L)∶1.0(7.20 mmol/L),油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例分别为2.0∶13.3∶1.0和9.6∶7.4∶1.0,各组添加的短链脂肪酸(SCFA)和长链脂肪酸(LCFA)总浓度为14.541 mmol/L,每组3个重复。培养24 h后,检测细胞相对增殖率(RGR)、甘油三酯(TAG)的合成量以及乳蛋白和乳脂合成相关基因的表达量。结果表明:1)试验组BMECs RGR及TAG的合成量均显著高于对照组(P0.05);Ⅰ组RGR最高,TAG合成量最多。2)与对照组相比,Ⅱ组显著提高了核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、κ-酪蛋白(CSN3)基因的表达量(P0.05);Ⅳ组显著提高了CSN3、蛋白激酶B(AKT)、S6K1、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达量(P0.05);试验组信号转导和转录激活因子5(STAT5)基因的表达量显著降低(P0.05)。3)与对照组相比,试验组二酰甘油酰基转移酶2(DG AT2)基因的表达量显著提高(P0.05),脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达量显著降低(P0.05)。综上所述,在培养液中添加7.20 mmol/L乙酸、7.20 mmol/Lβ-羟丁酸、75.20μmol/L油酸、58.00μmol/L亚油酸、7.80μmol/L亚麻酸对BM ECs乳蛋白和乳脂合成相关基因的表达量有较好的促进作用。     

激素和生长因子对山羊乳腺上皮细胞生长的影响

为了研究不同激素和生长因子对乳腺上皮细胞生长的影响.试验采用原代外植块培养法,经传代获得乳腺上皮细胞,添加不同浓度的FBS、EGF、胰岛素、氢化可的松和ITS,通过倒置相差显微镜观察,利用血细胞计数板来进行研究.结果表明: 5% 的FBS、10 μg/L的EGF、1 mg/L的胰岛素、0.1 mg/L的氢化可的松、10 mL/L的ITS对乳腺上皮细胞生长的影响较大.说明不同激素和生长因子对乳腺上皮细胞生长均具有调控作用,但作用程度不同.     

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的研究

利用脂质体包裹含人乳铁蛋白基因的重组质粒，并导入到山羊乳腺上皮细胞，经G418及PCR筛选获得阳性细胞；转染细胞增殖后经激素诱导，培养液上清通过Western blot检测证明，转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白，其分子质量为58ku。     

赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究赖氨酸(Lys)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂肪合成相关基因和蛋白表达的影响,探讨Lys影响乳脂肪合成的机理。将第3代BMECs随机分为6组,每组6个重复,每个重复1个培养孔。各组培养基中Lys的浓度分别为0.5(基础培养基,对照)、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/L,37℃、5%CO2培养48h后测定BMECs甘油三酯(TAG)含量、乳脂肪合成相关基因和蛋白的表达量。结果表明:BMECs内TAG含量(P=0.013)以及脂肪酸结合蛋白3(FABP3,P=0.001)、脂蛋白脂酶(LPL,P=0.096)、脂肪酸合成酶(FASN,P=0.003)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6,P=0.038)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM,P=0.022)基因表达量对Lys呈显著或趋于显著的浓度依赖效应。FABP3基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组和LPL基因表达量以1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);FASN基因表达量以2.0mmol/L组最高,显著高于16.0mmol/L组(P0.05);硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因表达量以2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05);磷脂酸磷酸酯酶1(LPIN1)、嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1 A1)和黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因表达量均以1.0、2.0、4.0、8.0mmol/L组显著高于0.5mmol/L组(P0.05);过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因及蛋白表达量均以2.0、4.0mmol/L组显著高于0.5和8.0、16.0mmol/L组(P0.05);固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)基因表达量以1.0、2.0、4.0mmol/L组显著高于其他组(P0.05),蛋白表达量以1.0 mmol/L组显著高于其他组(P0.05)。但高浓度Lys抑制AGPAT6和GPAM的基因表达,AGPAT6基因表达量以2.0、4.0、8.0、16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0mmol/L组(P0.05),GPAM基因表达量以16.0mmol/L组显著低于0.5、1.0、2.0、4.0mmol/L组(P0.05)。可见,Lys对BMECs的乳脂肪合成具有显著的促进效果,但高浓度的Lys抑制了乳脂肪合成相关基因的表达。本试验条件下,培养基中Lys适宜浓度为2.0~4.0mmol/L。     

脂肪酸结合蛋白5对奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成的影响

脂肪酸结合蛋白5（fatty acid binding protein 5,FABP5）是一种胞内脂质运载体。本试验应用甘油三酯测定法及BODIPY染色法检测奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cell,BMEC）中甘油三酯及脂滴分泌情况,采用实时荧光定量PCR、Western blotting技术检测BMECs中FABP5对固醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）的表达影响。结果显示,试验成功获得高纯度的BMECs,构建了pGCMV-IRES-EGFP-FABP5真核表达载体,且与空白对照组和空载体组相比,FABP5过表达组的甘油三酯和脂滴分泌量极显著增加（P<0.01）,同时SREBP-1c及靶基因FAS、ACC的表达量均极显著增加（P<0.01）;试验成功筛选了FABP5 siRNA1为最佳干扰片段,当FABP5抑制时,抑制组的甘油三酯、脂滴分泌量极显著减少（P<0.01）,SREBP-1c、FAS、ACC的表达量均极显著降低（P<0.01）。表明FABP5可通过上调SREBP-1c的表达从而促进BMEC中乳脂的合成。     

Effect of Fatty Acid Binding Protein 5 on Milk Fat Synthesis of Bovine Mammary Epithelial Cells

The fatty acid binding protein 5 (FABP5) is an intracellular lipid carrier. The TG GPO-POD assay kit and BODIPY staining methods were used to detect lipid secretion and triglyceride content,and the effect of FABP5 on SREBP-1c expression were detected by Real-time PCR and Western blotting methods. The results showed that high purity bovine mammary epithelial cells (BMECs) were successfully isolated and purified,and the eukaryotic expression vector pGCMV-IRES-EGFP-FABP5 was constructed in this experiment. Compared with the blank control group and empty vector group,the lipid secretion and triglyceride content, and the expression of SREBP-1c and FAS,ACC were extremely significantly increased when the FABP5 was overexpressed (P<0.01). FABP5 siRNA1 was selected as the optimal interference fragment, and when FABP5 was inhibited,the lipid secretion and triglyceride content,the expression of SREBP-1c,FAS and ACC were extremely significantly decreased (P<0.01).The results indicated that FABP5 could promote the synthesis of milk fat in BMEC by up-regulating the expression of SREBP-1c.     

含蛋氨酸二肽影响奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关基因表达

本试验旨在研究含蛋氨酸(Met)二肽对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳蛋白合成相关基因表达的影响。试验分3部分,均采用单因子完全随机试验设计,Met的添加浓度及培养时间分别为60μg/m L(0.402 mmol/L)、48 h。第1部分,培养液添加8种含Met二肽[蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)、蛋氨酸-赖氨酸(P-Met-Lys)、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-苏氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-异亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-缬氨酸(P-Met-Val)],以不添加二肽为对照,测定BMECs乳蛋白合成相关基因(αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、Ⅱ型小肽转运载体和氨肽酶氮)的表达量;第2部分,培养液添加8种与上述二肽对应的游离氨基酸(F-Met-Met、F-Met-Lys、F-MetTrp、F-M et-Phe、F-M et-Thr、F-M et-Ile、F-M et-Leu、F-M et-Val),以不添加游离氨基酸为对照,测定BM ECs乳蛋白合成相关基因的表达量;第3部分,用二肽等物质的量替代相应游离氨基酸,测定BMECs乳蛋白合成相关基因的表达量以及细胞内外氨肽酶含量。结果表明:P-Met-Met和P-M et-Lys组较对照组和其他二肽组上调了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白基因的表达量,且P-M et-M et组优于P-Met-Lys组。F-Met-Met和F-Met-Lys组较对照组和其他游离氨基酸组显著提高了αs1-酪蛋白基因的表达量(P0.05)。除P-Met-Val和P-Met-Leu组外,其他二肽替代游离氨基酸后均不同程度地提高了乳蛋白和Ⅱ型小肽转运载体基因的表达量,其中P-Met-Met表现出较好的促进效果。总之,含Met二肽等量替代对应的游离氨基酸能够促进乳蛋白基因的表达,其中尤以P-Met-Met的效果最好。     

激素对奶牛乳腺上皮细胞乳脂肪合成的调控作用

乳脂肪是高质量的天然脂肪,其可为人类提供营养和能量,在各种膳食脂肪和油类中,是最容易被消化吸收的。乳脂肪是在乳腺中由从头合成或外源摄取的脂肪酸与甘油酯化形成的一种脂类物质,其含量的高低关系着牛奶品质的优劣和乳制品的加工特性。在奶牛的泌乳周期中,乳腺泌乳功能受多种因素影响,其中内分泌腺分泌的多种激素对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）乳脂的合成具有积极的调控作用。综上所述,作者介绍了氢化可的松、催乳素、胰岛素和生长激素4种泌乳相关激素对BMECs乳脂肪合成的调控机理,即从乳脂合成适宜的激素添加量、激素对乳脂球形态的影响方面初步阐释其调控作用,并从乳脂合成的关键酶及转录因子、激素对乳脂合成相关基因表达量方面深入阐释其作用机理,旨在为研究泌乳相关激素对奶牛乳腺内乳脂肪合成的调控机理提供参考。