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《中国预防兽医学报》2015,(6)
为筛选新的高效的鸡痘病毒(FPV)中外源基因的插入位点,本研究选择FPV ORF161与ORF162之间的基因间隔区作为重组位点,构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转移载体,以表达鸡传染性喉气管炎病毒g B基因的重组FPV(r FPV-g B)为亲本病毒,通过在鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组,并经过蚀斑纯化筛选获得能够稳定表达gfp报告基因的重组病毒,命名为r FPV-g B161gfp。将r FPV-g B161gfp与亲本病毒连续传代20代,每5代进行荧光显微镜观察、PCR检测及复制动力学比较,结果表明重组病毒遗传稳定性良好,而且重组病毒与亲本病毒生长特性一致。本研究鉴定的新外源基因插入位点为构建多价重组FPV疫苗奠定了基础。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2018,(10)
为探寻鸭瘟病毒(DEV)基因组中的复制非必需区,本研究在已建立的DEV疫苗株5粘粒拯救系统的基础上,利用转座子随机插入技术,将含eGFP表达框架的基因片段随机插入DEV US区,救获两株表达绿色荧光蛋白的重组DEV(rDEV-us7eGFP、rDEV-us8us1eGFP)。将两株重组病毒在鸡胚成纤维细胞中连续传至20代后,通过PCR、荧光表达鉴定分析,结果显示gfp基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与DEV疫苗株无显著差异。攻毒保护实验结果表明,将rDEV-us7eGFP和rDEV-us8us1eGFP以10~5TCID_(50)的剂量免疫SPF鸭后,其对鸭瘟强毒攻击的保护效率与DEV疫苗株一致,均为100%。本研究成功筛选到DEV基因组中的两个可供外源基因插入的复制非必需区,分别位于us7基因内部及us8与us1基因之间,为以DEV为载体构建相关重组疫苗奠定了重要基础。 相似文献
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将重组鸡痘病毒在1种禽类细胞和13种哺乳动物及人的细胞内培养.通过电镜观察可见重组鸡痘病毒在CEE、BHK、PK、BTC、Vero细胞内的复制,同时用PCR方法扩增出目的基因,Western-blotting检测到目的蛋白,验证是鸡痘病毒.试验表明鸡痘病毒在禽类、个别哺乳动物细胞中可以复制,但尚未发现在人的细胞内复制;在CEF中可以稳定传30代以上;在BHK内第1代可以观察到细胞病变(CPE);在PK、BTC、Vero内第2代可以观察到CPE,证明鸡痘病毒在个别哺乳动物细胞发生复制,但不能稳定遗传. 相似文献
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将亚克隆获得的分别含有鸡痘病毒( F P V) Bam H I相应片段的 p U Fa、p U Fc 和 p U Fd 3 个质粒的单酶切位点,插入 P11 P7.5 Lac Z报告基因盒,构建成 p U Fa1、p U Fc1 和 p U Fd1 3 个重组载体质粒,在脂质体存在条件下,同 F P V 共同转染鸡胚成纤维细胞( C E F),96 h 后在 Xga1 存在条件下挑选蓝色重组病毒空斑,经3 次空斑纯化和传代,获得 1 株可稳定表达 β半乳糖苷酶的重组病毒,并对该重组用质粒作了序列分析。 相似文献
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利用蔗糖密度梯度离心纯化鸽痘病毒,以蛋白酶K法抽提病毒DNA,提取到分子量病毒DN、病毒DN经EcoRI、SalI,PstI酶切后各产生17、8和13个片段,病毒DNA的大小约为289.32kb。 相似文献
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以鸡胚成纤维细胞培养的中国鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株,经蔗糖密度梯度离心法纯化,电镜观察示所得病毒为典型鸡痘毒颗粒,以蛋白酶K法抽提病毒基因组,电泳结果为典型的大分子量DNA特征,经EcoRI或EcoRI/HindⅡ酶切,插入PUC19载体相应位点,经转化、筛选、鉴定后得相应酶切片段的基因组文库,对其中23个克隆片段用双酶法进行酶谱分析,绘制出相应克隆片段的酶切图谱,每个克隆片段中均有1-5个可以利用的 相似文献
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以鸡胚成纤维细胞培养的中国鸡痘病毒鹌鹑化弱毒株,经蔗糖密度梯度离心法纯化,电镜观察示所得病毒为典型鸡瘟病毒颗粒。以蛋白酶K法抽提病毒基因组,电泳结果为典型的大分子量DNA特征,经EcoRI或EcoRI/HindⅢ酶切,插入pUC19载体相应位点,经转化、筛选、鉴定后得相应酶切片段的基因组文库。对其中23个克隆片段用双酶法进行酶谱分析,绘制出了相应克隆片段的酶切图谱,每个克隆片段中均有1~6个可以利用的插入位点。基因组文库的构建及部分克隆片段的酶谱分析为进一步筛选病毒复制非必需片段以构建重组疫苗表达载体乃至鸡痘病毒分子生物学的研究打下了坚实的物质基础。 相似文献
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鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析 总被引:2,自引:1,他引:1
以限制性内切酶BamHI、Xbal、Clal、H1ndⅢ、Ncal对含有鸡痘病毒(FPV)282E4弱毒株3.7kbHindⅢTK基因片段的重组质粒pSL1进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明:3.7kbHindⅢTK基因片段上有2个Clal切点,2个Xbal切点,1个Ncal切点,没有BamHI切点。随后,用澳大利亚FPV2.2kbHindⅢ+ClalTK基因作探针,对各种酶切片段进行Southern印迹杂交,进一步确定TK基因位于2.2kbHindⅢ+Clal片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚FPV疫苗株的基本相同。 相似文献
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提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA,用HindⅢ酶切,随机克隆到pUC18质粒中,限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明,克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后,将它们和羊痘病毒Pellor(AY077835)株进行了同源性比较,发现核苷酸同源性为90。0%~94.5%,氨基酸同源性为83.0%~91.4%。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点,插入P11P7.5-LacZ报告基因,构建了pUAl、pUBl、pUCl和pUDl共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞,在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒,获得1株重组病毒,证明筛选出了1个复制非必需区片段。 相似文献
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表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
将转移载体P11SF和PN11SF分别与282E4株鸡痘病毒(282E4 strain fowlpox virus,282E4FPV)和大空斑株鸡疽病毒(large plaque strain fowlpox virus,LP FPV)共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝斑筛选,得到4株重组鸡痘病毒rFPV282E4-SFA、rFPVLP,-SFA、rFPV282E4-SFB和rFPVLP-SFB,通过PCR和间接免疫荧光鉴定均为阳性,另外将各重组病毒分别传20代,测其遗传稳定性,结果显示均具有良好的稳定性。对SPF鸡进行免疫效力试验,攻毒后均100%保护,而对于商品鸡,保护率分别为64%、60%、52%和88%。 相似文献
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鸡痘病毒的分离鉴定 总被引:3,自引:0,他引:3
本试验对湖北省某鸡场疑为“白喉型”鸡痘的病鸡进行了取样及病毒的分离与鉴定。经 10日龄鸡胚尿囊膜连续传代 3次 ,进行病毒分离、电子显微镜观察、理化特性测定、包涵体检查、血凝性测定及回归鸡试验等 ,证明所分离的病毒是鸡痘病毒。1 材料和方法1.1 病 料 湖北省某蛋鸡场死鸡口腔、喉头气管部病变粘膜及气管组织。1.2 病毒分离 将病料剪碎 ,加灭菌细砂 ,在研磨器中充分研磨 ,用Hank s液配成 1∶5的混悬液 ,并加入青霉素 10 0 0 0u/ml,水溶性氟哌酸 0 .3% ,将混悬液移入无菌瓶中并反复冻融 3次。 4℃下 ,将混悬液60 0 0r/… 相似文献
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鸡毒支原体DNA限制性内切酶分析 总被引:1,自引:0,他引:1
应用限制性内切酶BamHI,EcoRI和HindⅢ消化鸡毒支原体DNA,其电泳图谱能区别鸡毒支原体各株,比十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)更敏感,表明限制性内切酶分析为鉴别鸡毒支原体毒株,进行分子流行病学调查及确定在商品代鸡中是否疫苗株代替了MG野毒株提供了非常有用的工具。 相似文献
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鸡贫血病毒山东分离株的限制性内切酶酶切图谱多态性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
利用套式PCR扩增在病毒(CAV)687bp片段,分别以HaeⅢ,HinfⅠ和HpaⅡ酶切,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其限制性片段长度多态性。用该技术对我国山东分离株的分析表明,SJ1和SJ2与日本的TK5803株和瑞典的1/80和1/91株相同,应属于Tcdd用限制性内切酶酶切图谱多态性(RFLP)分类方法中的第2组。 相似文献
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王欣 《畜牧兽医科技信息》2003,19(7)
美布法罗大学认为,一般DNA病毒是在受感染细胞的细胞核中复制,而天花、猴痘等痘病毒的复制是在细胞质中进行的。因此无法利用宿主细胞核中的酶来制造病毒蛋白质,痘病毒通常自己产生酶来完成基因的表达及自身的复 相似文献