RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其蛋白表达载体构建

本试验采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体.经过相关检验,TGA2转录因子连接到pMXB10载体内含肽(Intein)的N端,成功构建包含TGA2转录因子的pMXB10-TGA2蛋白表达载体.     

腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体的构建

[目的】构建以甘露糖为筛选剂的抗旱、抗盐碱植物表达载体,进一步选育无标记的抗逆作物品种。[方法]利用腊梅花水通道蛋白CpTIP cDNA和大肠杆菌pmi基因构建植物表达载体,将抗逆基凶与甘露糖正向选择系统结合。pmi基因植物表达载体（pPMI）的构建：用XhoI酶切植物表达载体pCAMBIA2301,切除Kan基因,并用CIP酶进行去磷酸化,然后与XhoI酶切后PCR产物连接转化。腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体（pPMI：：CpTIP）的构建：用和nI和Xbal酶切pPMI植物表达载体和克隆载体,并将酶切后pmi植物表达载体与腊梅花水通道蛋白CpTIP基因连接转化。转化鉴定均按Sambrook等的方法进行。[结果]成功构建了腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体pPMI：：CpTIP。[结论]所构建的载体结合了抗逆基凶和忖露糖正向选择系统的优点,将抗逆基因与环境友好型筛选体系很好的结合起来。     

苜蓿MtCDPK1基因序列分析、克隆及表达载体构建

[目的]克隆苜蓿MtCDPK1基因,对其进行序列分析,并构建其表达载体。[方法]根据MtCDPK1基因的全长序列设计引物来克隆该基因,并用生物信息学方法对该基因表达的蛋白序列进行分析,最后通过酶切、连接、转化构建该基因的表达载体。[结果]试验成功克隆到了MtCDPK1基因,并证明MtCDPK1蛋白属于Ca2+依赖的蛋白激酶,同时成功构建了该基因的表达载体。[结论]该研究为苜蓿的遗传转化提供了良好的基础。     

腊梅花水通道蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体的构建

[目的]构建以甘露糖为筛选剂的抗旱、抗盐碱植物表达载体,进一步选育无标记的抗逆作物品种。[方法]利用腊梅花水通道蛋白CpTIP cDNA和大肠杆菌pmi基因构建植物表达载体,将抗逆基因与甘露糖正向选择系统结合。[结果]成功构建了腊梅花水通道蛋白印肿基因甘露糖筛选体系植物表达载体pPMI：：CpTIP。[结论]所构建的载体结合了抗逆基因和甘露糖正向选择系统的优点,将抗逆基因与环境友好型筛选体系很好的结合起来。     

菜豆荚斑驳病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆菜豆荚斑驳病毒(BPMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆BPMV CP基因,将其连接至pMD19-T Simple载体后对阳性克隆进行测序,检测其与已知病毒外壳蛋白基因序列的同源性;将CP基因定向插入双酶切的pET30a,构建其原核表达载体并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验克隆得到的CP基因大小为1 122 bp,与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;试验成功构建了原核表达载体pET30a-BPMV CP,发现重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导4 h条件下表达量最高。[结论]该研究为BPMV抗血清的制备与液相芯片检测方法的建立奠定了基础。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

角碱蓬液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆及表达载体的构建

[目的]克隆角碱蓬液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(ScNHX1),并构建其表达载体。[方法]以用400 mmol/L NaCl处理的角碱蓬为材料,利用RT-PCR技术从中克隆ScNHX1,并通过酶切、连接方法将ScNHX1连接至pCAMBIA1302载体中。[结果]试验成功克隆得到ScNHX1,测序得出该基因片段大小为1 617 bp,并成功构建了含该目的基因的表达载体pCAMBIA-ScNHX1。[结论]该研究为耐盐转基因植株的培育奠定了基础。     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因的原核表达

[目的]研究黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C（LDH-C）基因的原核表达及重组蛋白的纯化。[方法]采用RT-PCR方法克隆鼠兔LDH-C基因,并将其连接到表达载体pET-32a上,构建鼠兔LDH-C基因的大肠杆菌BL21（DE3）工程菌,通过IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析,使用亲和层析方法进行蛋白纯化。[结果]RT-PCR扩增出1条约1.0 kbp的条带,与预期结果相符;重组表达载体经PCR和双酶切鉴定,产生1个约1.0 kbp的目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,得到了分子量略大于45.0kDa以包涵体形式存在的融合蛋白;通过镍亲和层析柱进行纯化,得到了较纯的融合蛋白。[结论]黑唇鼠兔LDH-C基因被成功克隆和表达。 更多还原     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化(英文)

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cDNA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5 (Rf1b5 ),装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978 bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

水稻线粒体nad1基因超表达载体的构建和遗传转化

[目的]克隆线粒体相关基因nad1,获得转nad1的转基因水稻植株。[方法]采用TRIzol法提取水稻幼苗总RNA,以反转录的cD-NA为模板,扩增得到nad1;将nad1接到线粒体信号肽Rf1b的5’（Rf1b5’）,装载到pCAMBIA1305.1双元表达载体,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行遗传转化。[结果]克隆的目的基因nad1大小为978bp,成功构建了携带线粒体信号肽的nad1植物表达载体,并获得了转nad1基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中过表达nad1对水稻生长的影响奠定了基础。     

纹枯病菌诱导水稻表达的WRKY基因克隆及分析（摘要）

[目的]克隆纹枯病菌诱导的水稻上调表达基因。[方法]对应用抑制差减杂交技术（SSH）获得的纹枯病菌诱导水稻表达的EST序列K16进行电子克隆,根据电子克隆产物设计引物进行RT-PCR、克隆测序,利用生物信息学技术对克隆产物进行功能预测。[结果]克隆出一个长度为1079bp的序列,结构功能分析显示该基因编码236个氨基酸的蛋白,存在多个功能位点,含有2个典型的WRKY结构域和1个C2H2锌指型结构,该基因与水稻WRKY8、WRKY24和WRKY30基因有较高的同源性。[结论]经电子克隆获得的纹枯病菌诱导表达的基因为典型的WRKY家族基因,该基因可能在水稻抗纹枯病中起重要作用。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。