RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建

[目的]克隆植物广谱抗病基因NPR1并构建其蛋白表达载体。[方法]提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆NPR1基因;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体。[结果]经过相关检验,将NPR1正向插入pMXB10载体中,得到了pMXB10-NPR1蛋白表达载体。[结论]成功构建了包含NPR1的蛋白表达载体。     

RT-PCR法克隆拟南芥中NPR1基因及其植物表达载体的构建

园林植物多进行保护地栽培,高温高湿的局部小气候使园林植物更容易感染多种病害,一旦染病则极大地影响园林植物的观赏价值,造成较大的经济损失。文章采用RT-PCR扩增的方法从拟南芥基因组中克隆到能够介导植物广谱抗病的NPR1基因,并将其构建植物表达载体,为下一步的转化园林植物工作打下基础。     

RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其蛋白表达载体构建

本试验采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物,采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子;利用酶切连接方法,将该基因正向导入蛋白表达载体.经过相关检验,TGA2转录因子连接到pMXB10载体内含肽(Intein)的N端,成功构建包含TGA2转录因子的pMXB10-TGA2蛋白表达载体.     

RT-PCR法克隆广谱抗病基因TGA2及其植物表达载体构建

文章采用Trizol Reagent提取拟南芥总RNA,设计相关引物;采用反转录PCR方法克隆TGA2转录因子,利用酶切连接方法,将该基因正向导入植物表达载体。经过相关检验,结果表明,TGA2转录因子正向插入中间载体的CaMV35S启动子和T-nos终止子之间,成功构建包含TGA2转录因子的p35ST-TGA2植物表达载体。     

植物广谱抗病基因NPR1的研究进展

NPR1基因是影响植物广谱抗病性发生的重要调控因子,它主要调控病程相关蛋白的表达,对提高植物的抗病能力极为重要。目前对NPR1的研究已成为植物抗病基因工程的热点领域之一,但对其种类和同源基因等方面的研究却鲜有报道。因此,本文对NPR1基因的结构、功能、分类和最新的应用情况进行综述,对未来的发展趋势进行展望,为进一步丰富NPR1基因的研究提供一定的参考。     

玉米抗病相关基因NPR1的同源克隆及表达分析

NPR1是植物系统获得性(systemic acquired resistance,SAR)抗病反应中的关键基因,对植物的广谱抗性起重要调控作用。以玉米自交系"齐319"为材料,通过PCR方法克隆到一个玉米NPR1基因(命名为Zm NPR1)。序列分析结果显示Zm NPR1包含两个保守结构域POZ/BTB位点和Ankyrin repeat锚蛋白重复位点。蛋白质聚类分析表明Zm NPR1与水稻Os NPR2的同源性最高。亚细胞定位结果显示Zm NPR1定位于洋葱表皮细胞的细胞核中。半定量PCR结果显示,Zm NPR1和玉米防卫基因PAL(编码苯丙氨酸解氨酶)响应水杨酸、玉米矮花叶病毒和玉米小斑病原菌的诱导并显著上调表达;而Zm NPR1和PAL的表达水平受到茉莉酸甲酯的明显抑制。这表明Zm NPR1在玉米中参与到水杨酸介导的抗病反应通路。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.     

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。     

hbFGF基因的克隆及其植物双元表达载体的构建

[目的]为利用植物基因工程技术获取hbFGF基因奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法克隆hbFGF基因,将其插入双元表达载体pCambia1301中,构建植物表达载体pCambia1301-hbfgf,并将该表达载体导入发根农杆菌菌株C58C1。[结果]1%琼脂糖凝胶电泳结果显示,hbFGF基因被成功连接到克隆载体pMD18-T上,且重组质粒pMD18-T-hbfgf的DNA测序结果与GenBank中登录的hbFGFcDNA序列完全一致;双元表达载体重组质粒pCambia1301-hbfgf经BamHI消化后进行1%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,电泳图谱中出现1200、10000bp2个片段,说明hbFGF基因已被成功克隆到植物表达载体pCambia1301中;农杆菌转化子PCR产物电泳图谱中483bp处出现条带,说明pCambia1301-hbfgf已被转入农杆菌中。[结论]该研究成功获得了可直接用于遗传改良的工程菌pCambia1301-hbfgf-C58C1。     

甘薯NPR1基因半定量RT-PCR检测方法的建立

为进一步研究甘薯病原微生物的侵染对甘薯病程相关非表达子1基因(NPR1)表达的影响,以甘薯肌动蛋白(β-ac-tin)基因为内参照基因,提取甘薯叶片总RNA,反转录为cDNA,同批异管对该2个基因进行PCR扩增.通过对循环数的优化和对体系重复性、准确性的分析,建立了一个稳定、方便的半定量RT-PCR体系.     

拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建

拟南芥氨基酸透性酶1(AAP1,也叫NAT1)是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白,在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。本研究利用RT-PCR的方法,从拟南芥中克隆了该基因,测序结果与GenBank(NM-104616.4)中已发表的拟南芥AAP1(AtAAP1)基因的同源性高达99.93%;并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体,为过表达AtAAP1基因,提高作物氨基酸含量,从而改善作物氮素利用效率提供参考。     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

芪合酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

应用基因工程技术将从中国野生属葡萄种高抗白粉病的华东葡萄白河-35-1中分离出的芪合酶基因cDNA片段（Stilbene synthase，STS）进行PCR扩增；把回收的目的基因PCR产物定向插入克隆载体pGEM-TEasy中进行测序与序列分析；采用定向克隆的方法将芪合酶基因克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭型酿酒酵母表达载体pYES6／CT上，转化大肠杆菌，提取阳性重组质粒转化酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）菌株INVScl，酵母菌落PCR电泳结果显示，在约1200bp处有一条亮带，证明芪合酶基因酵母表达载体构建成功，为后期工作的开展奠定了基础，并为开发一种含有白藜芦醇生物活性成分的酵母微生态制剂提供了重要的实验素材。     

花生CEM1基因的克隆及表达载体构建

通过规模测序和生物信息学分析,从花生荚果不同发育时期全长cDNA文库中筛选出MADSbox家族的一个cDNA全长序列,命名为CEM1基因(GenBank登录号为EY396043)。该基因全长1 061 bp,包含762 bp的开放阅读框,编码253个氨基酸,蛋白质的分子量为29.405 ku,等电点(pI)为9.18。蛋白质信号肽分析和疏水性分析表明,该基因编码的蛋白质信号肽剪切的可能性很小,具有亲水性。同时构建CEM1基因的VIGS表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜BnClo1基因克隆、表达载体的构建及原核表达

【目的】克隆甘蓝型油菜(Brassica napus)油体钙蛋白(caleosin)基因BnClo1,并进行原核表达研究。【方法】在获得甘蓝型油菜BnClo1基因全长cDNA的基础上,根据BnClo1基因编码区设计1对特异引物,以甘蓝型油菜种子总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约750bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pTYB12中,构建融合表达载体pTYB12-BnClo1,转化到Escherichia coli ER2566(DE3)中进行表达。【结果】测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长768bp,包含完整的开放阅读框738bp,编码245个氨基酸残基,caleosin分子量为28.1kD。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以20℃、4mmol·L-1IPTG诱导该基因表达效果最好,诱导产物为一个与理论值相符的83.1kD的融合蛋白intein-caleosin。【结论】克隆了油菜BnClo1基因,并在大肠杆菌中进行了优化表达。为进一步纯化和鉴定目的蛋白,及研究其功能奠定了试验基础。     

中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1的分离和特性分析

【目的】NPR1是调控植物抗病反应的一个关键基因。对中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1进行分离和特性分析。【方法】利用RT-PCR和RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得TiNH1全长cDNA序列，利用Northern和Southern分别研究TiNH1表达特性及其在中间偃麦草基因组中存在形式。【结果】获得了该基因cDNA序列，命名为TiNH1。其编码蛋白TiNH1的氨基酸序列分别与水稻、烟草和拟南芥的NPR1同源性为80%、54%和46%。Northern杂交分析结果表明：TiNH1基因在正常情况下有微量表达，在小麦白粉病菌和纹枯病菌诱导下，该基因表达水平得到提高。Southern杂交分析结果表明；该基因以单拷贝形式存在于中间偃麦草基因组中。【结论】中间偃麦草NPR1同源基因TiNH1编码由580个氨基酸组成的蛋白质TiNH，具有已知NPR1蛋白保守的结构域和功能氨基酸，可能参与寄主对小麦白粉病菌和纹枯病菌的防御反应。