H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立

为快速检测H3亚型猪流感病毒(SIV),本研究将一株H3N2亚型SIV特异性单克隆抗体(MAb)进行纯化,建立了以多抗作为包被抗体,MAb作为检测抗体的H3亚型SIV抗原捕捉ELISA (AC-ELISA)方法.并对该方法的特异性和敏感性进行了分析,其敏感性是血凝试验的4倍,与猪繁殖与综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒以及H1、H5、H9亚型SIV均没有明显的交叉性反应,批间和批内重复试验变异系数均小于10％.应用建立的AC-ELISA方法对84份H3亚型SIV实验室感染样品进行检测与鸡胚滴定病毒结果符合率达90.47％.本实验建立的AC-ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于H3亚型SIV的临床检测.     

基于多重RT-PCR同时鉴定猪流感病毒不同HA和NA基因亚型的DHPLC检测方法的建立

为建立快速、敏感并同时鉴定不同HA和NA基因亚型的猪流感病毒(SIV)的方法。本研究根据SIV的H1、H2、H3、H5、H9、N1及N2亚型基因的保守序列分别设计型特异性引物,建立了同时扩增SIV不同亚型的多重RT-PCR及变性高效液相色谱(DHPLC)的高灵敏度和高通量分型检测方法。结果显示,该方法能够特异性的检测并鉴定H1、H2、H3、H5、H9、N1、N2等亚型SIV,而对猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒均无交叉反应,该方法的最低检出限为100拷贝/μL核酸。对76份猪流感鼻拭子样品临床样品检测结果表明,DHPLC与商业化荧光定量PCR检测试剂盒的检测结果完全一致。本研究建立的方法,特异性强、敏感性高、自动化程度高,为快速分型检测SIV提供技术支撑,并具有良好的应用前景。     

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达10²拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。     

分子信标荧光定量PCR检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

利用新型荧光探针—分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（SIV）的HA和NA基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用实时荧光定量PCR技术检测H3N2亚型SIV。构建重组质粒pSK-H3和pSK-N2并绘制标准曲线。结果显示,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验的重复性变异系数（CV）均小于3％,表明该方法灵敏度强、特异性好。此方法的建立将为流感病毒H3N2亚型定型检测提供一种快速有效的方法。     

H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确地检测H1和H3亚型猪流感病毒（swine influence virus,SIV）的方法,根据H1和H3亚型SIV血凝素（hemagglutinin,HA）基因保守序列,分别设计2对特异性引物和2条TaqMan探针,建立双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法敏感性高,可检测到最低拷贝数为10²拷贝/μL;重复性良好,重复孔Ct值的变异系数均在5%以下;特异性好,除H1和H3亚型SIV外,H4、H5、H7、H9亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒检测均为阴性;在田间样品中成功检出1株H1和1株H3亚型SIV,检出率为1.16%。该方法准确、快速、灵敏、特异,可为H1、H3亚型SIV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。     

数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立

试验旨在利用新型荧光探针--分子信标,建立一种检测猪流感病毒的新方法。根据H3N2亚型猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）的H3和N2基因的保守基因序列,分别设计并合成了特异性引物和分子信标探针,利用数字RT-PCR技术检测H3N2亚型SIV。结果显示,该数字RT-PCR检测方法与其他主要相关病毒均不发生交叉反应,重复性良好;对猪H3N2流感病毒而言,最低可检测到10⁶倍稀释的病毒株。数字RT-PCR方法能够对RNA模板定量分析。在H3N2 SIV的鉴定上,数字RT-PCR方法较实时荧光定量PCR方法更灵敏、准确。     

H1和H3亚型猪流感病毒二重TaqMan-MGB探针荧光RT-PCR检测方法的建立

根据H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)编码基因的保守序列,分别设计合成特异性引物和Taq Man-MGB探针,建立了一种检测H1和H3亚型SIV的二重荧光RT-PCR方法。结果显示,该方法仅对H1和H3亚型SIV呈特异性扩增,对H9亚型SIV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(SFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)无交叉扩增反应;用该方法检测H1和H3亚型SIV的HA基因的RNA标准对照(SIV-H1-RNA,SIV-H3-RNA),最适线性检测范围分别为3.7×10~1~3.7×10~8拷贝数/反应和3.4×10~0~3.4×10~8拷贝数/反应,最低检出限分别为38和34个拷贝数;该方法的组内试验和组间试验的变异系数均小于2.0%,显示其具有良好的可重复性。用该方法对520份进口猪的鼻拭子样本和78份国内猪鼻拭子样本进行SIV检测发现,进口猪鼻拭子样本的SIV检测结果均为阴性,12份国内猪鼻拭子样本的H1亚型SIV检测结果为阳性,5份国内猪鼻拭子样本的H3亚型SIV检测结果为阳性。本方法的建立为H1和H3亚型SIV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

H1亚型猪流感病毒微滴数字RT-PCR定量检测方法的建立

本研究针对H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)HA基因保守序列设计引物和探针,通过反应条件优化,建立了一种快速、准确检测H1亚型SIV的微滴数字RT-PCR定量方法。该方法特异性强,除H1亚型SIV外,H3、H5、H7亚型SIV以及猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等检测均为阴性;敏感性高,最低可检测4.7拷贝/μL;重复性好,对5个不同稀释度的H1亚型SIV RNA进行3次重复试验,每个稀释度的变异系数均小于5%。利用该方法对湖南省规模化养殖场收集的30份猪鼻拭子样品进行检测,发现与荧光RT-PCR检测结果一致。试验表明,该方法快速、准确、灵敏,可为H1亚型SIV的快速筛查及流行病学研究提供可靠的技术保障。     

H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV多重PCR检测方法的建立及应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染肺泡巨噬细胞,严重损害免疫系统,导致与其他病毒共感染现象,其中猪流感病毒(SIV)也是病原之一。为了快速检测和区分PRRSV基因型与SIV亚型,本研究针对H1、H3亚型SIV的HA基因和美洲型、欧洲型PRRSV的N、M基因的保守序列,分别设计了4对特异性扩增引物,在引物浓度、退火温度等反应条件的系统优化下,分别对其特异性和敏感性进行验证,建立了能够快速检测以上4种病原的多重PCR方法,并对155份临床样品进行了检测。结果显示,该检测方法特异性好、灵敏度高,对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV的最低检出量均低至9.86×10⁰ copies/μL。以单一PCR方法对所有临床样品进行检测后发现,检测结果与多重PCR检测结果一致,证明这种多重PCR方法可以用于这4种病毒的快速检测与分型鉴定。     

H3亚型禽流感病毒巢式PCR检测方法的建立

为建立一种H3亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,本研究针对H3亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法。对该法进行特异性和敏感性检验,并用该法对96份临床样品进行检测。特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV,对其他常见禽病病原体不扩增;敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为1×10³拷贝/μL,灵敏度比常规PCR高100倍;96份临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究所建立的巢式PCR为H3亚型AIV的诊断提供了一种准确、有效的检测方法。     

广东省部分地区规模化猪场猪流感病毒感染的血清学调查与分析

为了解广东省规模化猪场猪流感病毒(SIV)感染情况,本研究采用ELISA方法和血凝抑制试验(HI),对2011年～2012年采集的1 050份血清样品进行SIV血清学检测.两种检测方法结果显示1 050份血清样品中SIV抗体阳性率分别为50.4％(ELISA)和50.2％(HI).其中珠三角地区和粤东地区的感染率高于粤西地区.SIV亚型调查结果显示该地区流行的SIV主要为H1和H3亚型,抗体阳性率分别为39.2％和18.2％(ELISA).部分猪场存在H9亚型SIV抗体.部分猪群中同时存在H1和H3两种亚型SIV抗体,表明猪群中存在不同亚型SIV混合感染.本研究为广东省猪流感的预防提供参考依据.     

猪流感病毒LAMP检测方法的建立

本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法检测猪流感H3N2亚型病毒方法的建立

本试验针对H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因建立SYBR Green Ⅰ荧光RT-PCR检测方法.根据GenBank上的SIV N2基因序列设计一对引物,扩增片段406bp.纯化扩增目的片段后连接pMD18 T载体中,命名为pMD18-TN2,转化入E.coli DH5α,测序正确作为阳性模板,优化反应条件建立方法.此荧光PCR方法所能检测最低病毒含量为75 copies/μL,拥有良好的特异性和重复性.此方法的建立将为流感病毒N2亚型神经氨酸酶基因定型检测提供一种有效方法.     

猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立

根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出10⁴ EID₅₀病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出10⁴ EID₅₀病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。     

鸡细小病毒与H_9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

为建立一种能够同时鉴别诊断鸡细小病毒、禽流感病毒且同时区分H9亚型禽流感病毒的检测方法,本研究根据GenBank中已发表的ChPV的NS基因、AIV最保守的M基因和H9亚型AIV的HA基因的保守序列,分别设计引物,并通过对温度和反应体系的优化,筛选出最佳的三对特异性引物组合,建立了一种能同时检测ChPV、AIV和H9亚型AIV的三重PCR检测方法。特异性试验结果表明,建立的三重PCR方法可以在一PCR反应中同时检测ChPV、AIV和H9亚型AIV,其它常见的禽病病原体均未见阳性反应,该三重PCR方法特异性良好;敏感性试验表明,该三重PCR检测方法对ChPV、AIV和H9亚型AIV的检测下限均为5×104拷贝/μL质粒;运用该法对130份临床样品进行检测,结果与ChPV PCR阳性产物测序及AIV分离测序结果完全一致。因此,本研究建立的ChPV和H9亚型AIV三重PCR检测方法是一种特异性良好、灵敏度高、简便有效的检测方法。     

禽流感病毒 H3N2亚型三重 RT-PCR 检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒（AIV ）且同时区分 H3N2亚型AIV 的方法,本研究根据 H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M 基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT‐PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518 bp为AIV M 基因、418 bp为N2亚型AIV NA基因、271 bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518 bp、271 bp和518 bp、418 bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518 bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对 H3N2亚型AIV的检测下限为100 pg ;96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M 基因三重RT‐PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。     

鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种同时快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和所有亚型禽流感病毒(AIV),且可同时进行H9亚型AIV分型检测的多重PCR检测方法。针对Gen Bank中DTMUV NS2基因、所有亚型AIV的M基因和H9亚型AIV的HA基因的保守序列,分别设计了3对特异性引物,建立了DTMUV和AIV多重PCR检测方法。该方法对混有H9亚型AIV和DTMUV的模板进行PCR扩增,得到了3个大小与试验设计相符的特异性扩增条带,对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检测到45 pg的DTMUV、7.6 pg的H9亚型AIV和76 pg的M基因。研究建立的多重PCR检测方法,具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。     

人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析

本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％;与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％;M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.     

河南省部分地区猪流感血清学调查

采用血凝抑制试验对河南省新乡、焦作、漯河等地采集的139份猪血清样品进行了猪流感病毒H1、H3、H5、H9亚型抗体的检测。结果显示,在被调查的139份血清中,H1亚型SIV抗体阳性率为43．17％,H3亚型SIV抗体阳性率为0,H5亚型SIV抗体阳性率为2．16％,H9亚型SIV抗体阳性率为1．44％;H1＋H5亚型SIV抗体阳性率为1．44％：H1＋H9亚型SIV抗体阳性率为1．44％;H1＋H5＋H9亚型SIV抗体阳性率为0。表明在所调查的猪群中,猪流感病毒的感染较为普遍,大部分猪场都曾被H1亚型感染,部分猪群有多种亚型混合感染存在。     

检测H1和H3亚型猪流感病毒多重RT-PCR方法的建立

猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)危害猪体健康,影响生长性能,SIV常常与其他病毒和细菌双重或多重感染,使病情加重,死亡率增高[1].目前,猪流感(SI)已遍布美洲、亚洲和欧洲等世界各地,已成为规模化猪场的常发呼吸道传染病之一[2].特别是近年来禽源流感病毒在猪体内的发现更引起人们的关注[3].当前我国流行的SIV主要是H1和H3亚型[4-5].PCR方法特异、敏感、快速、简便,可从临床样品中直接进行诊断和鉴别,而不需要进行病毒分离和其他辅助性试验,是一种很有价值的检测手段.本研究建立的多重RT-PCR方法可同时达到对猪流感病毒诊断及H1和H3亚型鉴定目的,节约了时间和成本.