同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒多重PCR方法的建立

为建立检测多种犬病的多重PCR方法,本研究根据GenBank登录犬瘟热病毒(CDV)的N基因序列、犬细小病毒(CPV)的NS基因序列和犬腺病毒(CAV)的E3基因序列,设计合成3对特异性引物.通过优化反应条件,建立同时扩增CDV (507 bp)、CPV (287 bp)、CAV-Ⅰ (590 bp)和CAV-Ⅱ(1 027 bp)的多重PCR方法.实验结果表明:在同一PCR反应体系中可以同时检测以上4种病毒,而狂犬病病毒检测为阴性;CDV、CPV、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的最低检出限分别为101.9 TCID50、101.7 TCID50、101.7 TCID50和102.2 TCID50.利用该方法对由黑龙江省不同地区所采集的30份犬病料样品进行检测,CDV阳性率为23.33％(7/30)、CPV阳性率为20％(6/30)、CAV-Ⅰ和CAV-Ⅱ的阳性率均为3.33％(1/30),证明建立的PCR方法可以用于临床诊断.     

PCR法检测犬细小病毒的研究进展

聚合酶链反应是一种体外扩增特定DNA片断的技术,能快速、特异地在体外扩增特定的DNA片断,使之在短时间(数小时)内特异地扩增数百万倍.目前,在临床上聚合酶链反应方法已被广泛应用于DNA的检测.本文就聚合酶链反应检测细小病毒的研究作一综述.     

犬细小病毒和犬冠状病毒双重PCR方法的建立及应用

根据GenBank中犬细小病毒(CPV)和犬冠状病毒(CCV)基因序列各设计了一对引物,经试验条件的优化,建立了检测CPV的PCR方法和CCV的RT-PCR方法,扩增目的片段大小分别为337 bp和852 bp.在此基础上建立了检测CPV和CCV双重PCR方法.该双重PCR方法能特异的扩增CPV和CCV,且分别扩增出1...     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1／R1和GPVF1／R1，建立了一种PCR方法，用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒（DPV）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）、犬细小病毒（CPV）和猫泛白细胞减少症病毒（FPLV）的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果，引物MDPVF1／R1仅特异性扩增出MDPV的900bp核酸片段，引物GPVF1／R1仅特异性扩增出GPV的465bp核酸片段。表明，建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

根据已报道的猪细小病毒基因组序列，设计并合成了1对寡核苷酸引物，通过对影响PCR扩增因素的筛选，成功地从猪细小病毒感染的组织和细胞中扩增出445bp片段，回收该片段用EcoR I酶切得到了预期的结果，证实了该扩增片段的特异性。敏感性试验表明，该方法可以检测出10^-4个TCID50的病毒含量。利用该方法对临床上24份流产病科的检测，查出阳性16份，而同时利用HA检测阳性只有10份。这些结果说明本试验建立的PCR诊断方法灵敏度高、特异性强。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上发表的犬瘟热病毒融合蛋白F基因序列,设计合成了1对寡聚核苷酸引物,扩增大小为337bp的目的片段,建立犬瘟热病毒F基因的RT-PCR检测方法。结果表明,该方法具有很强的特异性和很高的敏感性,可作为犬瘟热临床快速诊断的一种方法。     

三种犬呼吸道常见病毒多重PCR检测方法建立

为建立犬呼吸道冠状病毒(Canine respiratory coronavirus,CRCoV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)3种病毒的多重PCR方法,根据GenBank中CRCoV、CPV和CDV的基因序列,进行BLAST同源性分析,找出保守序列,并根据保守序列对每个病毒设计引物,建立扩增3种病毒的多重PCR方法,并通过已建立的方法对收集的呼吸道病犬病料进行检测。结果表明,所建立的三重PCR体系组成为2×Taq Mix 12.5μL,3对上、下游引物各0.6μL,混合模板1μL,ddH₂O 7.9μL;扩增程序为94℃5 min;94℃30 s,54℃1 min,72℃24 s,共35个循环;72℃8 min。该方法具有较高的灵敏性和特异性。临床验证实验表明,本实验所建立的多重PCR方法可用于临床诊断。     

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank中发表的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,预期目的条带约591 bp。对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,建立了PPV的PCR检测方法。符合性实验结果表明,该PCR方法优于HA、VI以及IHA。使用该方法对215份病料进行了检测,检出阳性样品25份,检出率为11.63%。结果表明,该方法可用于PPV的诊断及流行病学监测。     

犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立与评价

通过序列比对和Blast分析,选定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白保守区基因为检测的目的基因,引物采用Primer Premier 5.0软件设计。利用灵敏度较高的TaqMan探针法建立CPV核酸检测方法。通过对标准品的扩增、测序及对标准扩增曲线的绘制,建立CPV核酸检测方法。同时对建立的检测方法进行了检测特异性、灵敏度和重复性分析。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后可检测到102拷贝/μL样品,表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。通过分析表明,本检测方法在用空白对照及类似的猪细小病毒、猪圆环病毒作为扩增对照时,没有发现非特异性产物的产生,表明该体系对于CPV的检测是特异的。通过6次批间重复检测,体系的变异系数小于3%,表明该检测体系具有良好的重复性。     

犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测

根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV) VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断.结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342 bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4 pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸捡测结果进行比较,吻合率为90.0％.将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3％.大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚.     

二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究

根据鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA聚合酶基因和鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)NS基因序列分别设计2对引物,应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明2条特异性带为563bp(DPV)和1146bp(GPV),与实验设计相符,且与常规单一PCR结果一致。二重PCR反应检测出的DPV含量相当于20个PFU;检测出的GPV含量相当于0.1个ELD50,对禽痘病毒和减蛋综合征病毒的核酸未能扩增出任何条带,特异性良好。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒,为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。     

犬细小病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank中CPV VP2蛋白基因序列,选择CPV VP2基因保守序列,分别设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立了CPV Taq Man荧光定量PCR检测方法。对CPV Taq Man荧光定量PCR的反应体系和反应条件进行优化,并对其特异性和敏感性进行了测定,建立标准曲线。结果,CPV Taq Man荧光定量PCR对CPV检测阳性,并能对10拷贝/μL的CPV模板检测阳性,标准曲线的相关系数为0.9992,但对非CPV模板检测阴性。结果表明,所建立的CPV Taq Man荧光定量PCR具有很好的特异性和敏感性,标准曲线具有很强的实用性。同时对CPV Taq Man荧光定量PCR与CPV PCR进行了比较试验,结果前者比后者的敏感性高100倍。采用CPVHA、CPV PCR与CPV Taq Man荧光定量PCR对55份临床样品进行检测,CPV HA对30份样品检测阳性,CPVPCR对40份样品检测阳性,CPV Taq Man荧光定量PCR对47份样品检测阳性。这表明,CPV Taq Man荧光定量PCR对样品的检出率最高,具有特异、敏感、快速的特点,适用临床样品的检测。     

RT-PCR检测贵州犬瘟热病毒

根据犬瘟热病毒H基因核苷酸序列 ,设计合成一对引物对贵州临床诊断为犬瘟热 (CD)病死犬的心、肝、脾、肾、粪便进行RT PCR检测。结果表明 :从心、脾、肾病料上清液中可扩增出 760bp的特异性带 ,与预期扩增片段长度相同 ;粪便和肝脏上清液RT PCR结果为阴性 ,但粪便上清液接种Vero细胞后连续传代 3代 ,每代细胞培养液RT PCR结果均为阳性 ;在检测的 2 2条病死犬中 ,有 1 9条病死犬检测到犬瘟热病毒H基因的特异性核酸片段 ,阳性率为 86 4% (1 9/ 2 2 )。     

犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

为建立一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP),本研究通过比对野毒株与疫苗株H基因设计特异性引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP和反应温度等条件分别进行优化,建立用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株的RT-LAMP。建立的RT-LAMP方法检测CDV野毒株时,在65℃水浴锅中反应40 min即可完成。该方法具有高度特异性,对犬细小病毒、犬腺病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒无交叉反应,敏感度可达40 copies/μL,是常规RT-PCR方法的100倍。     

荧光定量RT-PCR法对犬瘟热病毒PS株感染犬血清和粪便中病毒的检测

为研究犬人工感染犬瘟热病毒(CDV)后病毒在血清和粪便中的含量及变化,本实验根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列设计一对特异引物,扩增NP基因.并以NP基因重组质粒作为阳性标准品,建立检测CDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法.结果表明,该方法102拷贝～109拷贝范围内具有良好的线性关系,相关系数为R2=0.998,扩增效率为E=98.3％,敏感度高,最低检测限为6.1拷贝/μL,重复性检测变异系数低于2.62％.该方法与常规RT-PCR方法比较,其敏感性提高102倍.两只人工感染CDV PS强毒株的犬,分别于接种后17d、19d发病死亡,采用荧光定量RT-PCR方法对人工感染犬的血液和拭子液中的病毒核酸栽量进行定量检测以及对收集的22份临床样本拭子液进行检测,均检测到CDV.本研究结果表明,该方法可以用于CDV核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种快速和敏感的检测手段.     

SYBR Green荧光RT-PCR法快速检测毛皮动物源犬瘟热病毒

根据犬瘟热病毒(CDV)H蛋白基因的保守序列设计了1对引物,经过各反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了CDV的SYBR GreenⅠRT-PCR荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,建立的方法特异性较好,几种非CDV病原体检测均为阴性;敏感性实验表明其敏感性可达1个TCID50,高于普通RT-PCR和胶体金检测试剂盒;重复性试验表明所建立的检测方法非常稳定;临床检测中,在39份样品中检测到28份阳性样品,高于普通RT-PCR方法的检出率。该方法检测成本低、特异性强、敏感性高、重复性好,可推广应用于毛皮动物CDV的大规模高通量的检测。     

贵州犬瘟热病毒的分离鉴定

对流行病学调查、临床症状检查和ELISA检测为犬瘟热阳性的自然发病犬,取肠内容物为病料,采用同步培养方法接种于犬肾细胞系(MDCK)进行病毒的分离,并对分离株进行了形态学特征、血凝特性、动物感染及RT-PCR鉴定。结果表明:病料接种MDCK细胞产生明显的细胞病变(CPE),电镜负染观察接毒细胞培养物见有典型的犬瘟热病毒粒子。分离株不凝集鸡及人“O”型红细胞,接种犬出现明显的临床症状和病理变化。用RT-PCR技术检测病毒细胞培养液,扩增出的片段长为760 bp,与预期设计的长度相同,由此确证分离株为犬瘟热病毒,命名为CDV-GZ2株。     

鸭瘟病毒、鹅细小病毒和番鸭细小病毒三重PCR检测方法的建立

为建立鉴别鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的多重PCR检测方法,参考文献合成针对DPVUL6基因、GPVNS基因和MDPVVP1基因序列的特异性引物。通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。结果显示,该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性,表明特异性较强;DPV、GPV和MDPV的最低核酸检出量分别为237.3pg、22.45pg和204.6pg,表明敏感性良好;该方法对DPV+GPV+MDPV、DPV+GPV、DPV+MDPV、GPV+MDPV、DPV、GPV和MDPV的核酸均能扩增出与预期大小一致的目的条带,表明该多重PCR方法重复性较好。本研究方法具有特异性强、敏感性良好、重复性较好和快速简便等特点,可用于DPV、GPV和MDPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。