烟草orf25基因植物表达载体的构建及遗传转化

为更好地研究烟草雄性不育的机理,构建orf25基因的植物表达载体。orf25基因是ATP合成酶F(0)部分的4个亚基因之一。以雄性不育烟草MS革新3号为受体材料,利用组成型启动子Ca MV35S构建orf25基因植物表达载体,将表达载体p BI121-orf25导入根癌农杆菌LBA4404。采用根癌农杆菌介导orf25基因遗传转化MS革新3号,结果证明载体上的目的基因orf25已整合到烟草基因组中,并获得了52株转p BI121-Ca MV35Sorf25基因烟草植株,经PCR鉴定,转基因阳性植株有14株,转化率为26.9%。为下一步研究该基因的功能及其与烟草雄性不育性的关系提供依据。     

玉米蛋白激酶基因ZmASK1表达载体的构建及遗传转化

为了研究玉米蛋白激酶基因ZmASK1的功能,把ZmASK1的cDNA连接到植物表达栽体pGreen0029中,通过农杆菌介导转入拟南芥中进行过量表达.PCR和Western-blot分析表明,ZmASK1已经转入到拟南芥中,并且在大多数转化植株中稳定表达.通过本试验,为以后对ZmASK1的功能验证工作打下基础.     

小麦WZY2基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

【目的】利用基因枪将WZY2基因RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri导入"郑引1号"小麦,获得WZY2基因表达缺失型小麦,为深入分析WZY2基因功能奠定基础。【方法】以植物表达载体pAHC25为基础,构建含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WZY2-Ri,利用基因枪将其转入"郑引1号"小麦幼胚愈伤组织中,经过筛选、PCR检测得到阳性植株。【结果】从转化的1 500个愈伤组织中获得27株再生植株。利用PCR对再生植株进行检测,获得阳性植株3株,转化率为0.2%。【结论】构建了WZY2基因的RNA干扰表达载体,成功地将WZY2基因RNA干扰表达载体导入"郑引1号"小麦,获得阳性植株。     

RinPKS1基因过表达载体的构建及遗传转化树莓

RinPKS 1基因编码的蛋白是具有催化合成柚皮素查尔酮和苯亚甲基丙酮的能力双功能酶,即具有CHS和BAS活性。BAS又是树莓酮生物合成途径中的关键酶。【目的】为了验证RinPKS 1在树莓酮生物合成途径中是否发挥作用。【方法】将RinPKS1基因与pCambia 1304连接,构建成植物过表达载体PCA-RinPKS 1,通过根癌农杆菌介导,将RinPKS1遗传转化入树莓中,以提高树莓中树莓酮的含量。利用q-PCR分别检测转PCA-RinPKS1和阴性对照(空载体)的树莓材料中RinPKS 1基因的表达量。【结果】转RinPKS1基因树莓材料中RinPKS1的表达量比转阴性对照(空载体)有很大提高,分别是根高出15.8倍;茎高出3.17倍;叶高出4.39倍。【结论】RinPKS 1在树莓中得到转录水平过表达。     

OsWAX2基因的植物表达载体构建及遗传转化

利用拟南芥的WAX2基因序列,BLAST检索出3个水稻同源基因,分别命名为OsWAX2-1,OsWAX2-2,OsWAX2-3,与拟南芥WAX2基因的同源性分别为56.0%,55.2%,52.0%;其预测的编码蛋白与WAX2蛋白的同源性分别为61.5%,60.5%,64.7%.这3个蛋白都存在4个跨膜结构和2个固醇去饱和酶的保守区,说明这3个蛋白质都属于跨膜蛋白,并可能与角质层的蜡质合成有关.从全长cDNA数据库检索获得了3个OsWAX2的全长cDNA.以pCAMBIA-1300-multi为载体,构建了CaMV35S启动子驱动的3个OsWAX2的过表达载体pOEOSW2-1,pOEOSW2-2,pOEOSW2-3及3个RNAi表达载体pCROSW2-1,pCROSW2-2,pCROSW2-3,并通过冻融法将6个表达载体转化到根癌农杆菌EHA105,LBA4404和GV3101中,采用农杆菌介导法进行水稻日本晴品种的遗传转化,得到了具有Hyg抗性的水稻转基因苗,PCR检测到阳性植株.     

籽粒硬度Pinb基因反义表达载体构建及遗传转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状.利用含有Ubi启动子、Bar表达盒的基础质粒pAHC25,构建了含有Pinb基因的植物反义表达载体pAHantipB,其中pAHantipB载有小麦籽粒硬度Pinb基因的反向序列,可用于小麦遗传转化,利用花粉管通道法将其转入软质小麦品种京411,获得1株转基因植株,T1代转基因植株抗性筛选及PCR12检测结果表明,转化率为0.17%.基因组DNA斑点杂交证实了外源基因在受体小麦基因组中的整合.     

cry Ia基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因cryIa的现有载体进行了改造,并引入了筛选标记基因bar,为提高目的基因的表达水平,还在目的基因5′端引入了Ω和Kozak序列,3′端引入了poly(A)序列。成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4ABBar,该载体含有顺向连接的Ubi-cryIa及Ubi-bar基因表达盒,可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化,人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因cryIa可以编码对鳞翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

二氢黄酮还原酶基因植物表达载体构建及对烟草的遗传转化研究

以pBI121为基础载体,通过分步酶切连接分别构建组成型CaMV35S启动子、光合组织特异型PNZIP启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR和pPNDFR;采用直接转化法将pBIDFR和pPNDFR导入根癌农杆菌菌株,采用pPNDFR/EHA105菌株对普通烟草进行了遗传转化研究.在Kanamycin选择压力下获得了烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR鉴定,该DFR基因已成功导入烟草基因组中.     

小麦GPX基因的克隆及植物表达载体构建

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是植物体内清除活性氧的主要酶,与植物抗逆性紧密相关。为利用农杆菌介导法转化小麦以及提高小麦抗逆能力奠定基础,采用RT-PCR方法从小麦品种新麦26中克隆GPX基因的编码区序列,运用T-A克隆方法克隆pGM-T载体,通过酶切、连接和转化等技术构建植物表达载体。结果表明:扩增到约为500bp的GPX基因,成功构建植物表达载体pBI121-GPX,并导入农杆菌LBA4044中。     

番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化

克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基因(TYLCV-Rep),并构建其植物表达载体,通过农杆菌介导法转入番茄子叶外植体。经过共培养、潮霉素筛选和分化再生,获得21株潮霉素抗性植株。PCR检测和Southern Blot检测结果表明,有3株呈阳性检测反应,说明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因组中,阳性率为14.3%。烟粉虱接种试验结果表明,番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。     

水苏糖合成酶基因重组载体的构建及转化农杆菌

以黄瓜叶片中提取的总RNA为模板,经PCR扩增得到长度为1 275bp的基因片断,经过酶切测序之后,将目的基因连接到表达载体,构建成重组质粒。再利用液氮冻融法将表达载体转化农杆菌感受态。     

小菊'类锌指蛋白'基因植物表达载体构建及对烟草的转化

为了建立耐盐碱小菊(Chrysanthemum morifolium)中克隆到的'类锌指蛋白基因'CmSTZF(DQ864730)的烟草遗传转化体系,并研究其抗逆特性。本研究借助Gateway技术构建了小菊'类锌指蛋白'基因CmSTZF的过量表达载体pH7WG2D-CmSTZF,并以烟草NC89(N.plumbaginifolia'NC89')的叶片为试材,通过农杆菌介导的转化,成功地建立了烟草遗传转化体系,经PCR-Southern鉴定获得CmSTZF的转基因烟草株系。     

Pina和Pinb融合基因表达载体的构建及其在硬粒小麦中的转化

 【目的】构建Pina、Pinb融合基因表达载体，验证Pina和Pinb基因的功能，为利用转基因技术改良小麦籽粒质地提供理论依据和基础材料。【方法】以软质小麦京411作为Pina和Pinb基因的供体，将Pina、Pinb基因融合后，与基础质粒pG4AB上的Ω和poly(A)等增强基因表达的调控序列及pAHC25上的Ubiqutin启动子和bar基因表达盒相连接，构建Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体。利用基因枪转化硬粒小麦幼胚，并对硬粒小麦幼胚再生体系进行探索。【结果】在构建完成Pina、Pinb融合基因植物高效表达载体pFUBPaPb的基础上，转化硬粒小麦幼胚16 000多枚，经biolaphos筛选、PCR鉴定和斑点杂交鉴定，得到再生植株2 390株，35株为阳性植株。共得到T1代籽粒356粒，对种子量较多的16个单株籽粒进行蛋白表达分析，有2株检测到基因表达产物，其籽粒SKCS硬度值比受体品种分别降低了10和12。培养基SD2适于硬粒小麦幼胚愈伤组织的诱导，MS+8 mg•L-1玉米素可获得较为理想的再生频率。【结论】Pina和Pinb的共同表达降低了硬粒小麦籽粒硬度，具有软化籽粒质地的功能。     

甘露聚糖酶基因在烟草中的表达

构建了携带湖北大学生命科学学院分子微生物与基因工程实验室克隆的甘露聚糖酶基因的重组植物表达载体pLM50,转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,LBA4404),再用农杆菌介导的叶圆盘法对烟草(Nicotiana tabacumL.)叶片进行遗传转化,在含卡那霉素的MS筛选分化培养基上筛选。结果获基因转化烟草植株4株;经PCR、Western blot等方法检测,证明man基因在烟草转化植株中得了表达。     

联合双基因表达载体的构建及其拟南芥转化

[目的]为了研究CBF3冷诱导转录因子和细胞渗透调节物质AtGloS3在抗寒中的相互作用,寻找理想的抗寒转基因方式。[方法]根据GenBank中拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组序列设计引物,通过PCR反应克隆包括CBF3(C-repeat Binding Factor 3)基因以及基因上游启动子的DNA序列:CP-CBF3,共2 075 bp。CP是CBF3基因的启动子,受低温诱导。用EcoRI和BamHI双酶切CP-CBF3并置于植物表达载体pCAMBIA1300中,构建CBF3基因冷诱导表达载体pCA-CP-CBF3。然后将带有组成型启动子的肌醇半乳糖苷酶基因AtG-loS3合并于pCA-CP-CBF3中,构建双基因植物表达载体pCA-CP-CBF3-35S-AtGloS3。用真空抽滤虑法将这两个表达载体转化到拟南芥中,并用潮霉素筛选出转基因植物苗。[结果]CBF3和AtGloS3基因均来自拟南芥,而CBF3不存在内含子,AtGloS3基因存在内含子,故以CB-1、CB-2为引物的非转基因植物中也能得到带,而以AT-1、AT-2为引物的非转基因植物不能得到带。[结论]该研究中pCA-CP-CBF3是1个对照,实验的后续工作需进一步进行。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

小麦SnRK2.2基因克隆、表达载体构建及转化

SnRK2基因家族成员参与蛋白质的磷酸化,在植物抵御非生物胁迫方面发挥重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列为基础,通过RT-PCR技术克隆得到一个新的小麦SnRK2基因,命名为Ta SnRK2.2,并提交到Gen Bank(登录号:KJ850253)。Ta SnRK2.2基因全长4 118 bp,由9个外显子和8个内含子组成,包含一个1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守,Ta SnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。Ta SnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 k D,理论等电点为5.45,含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域和多处磷酸化位点。构建了Ta SnRK2.2基因过表达载体,转化拟南芥,获得转基因植株,通过RT-PCR方法检测到Ta SnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达。     

反义LeEIL2基因表达载体的构建及在番茄中的转化

为了研究LeEIL2基因在番茄果实成熟过程中的作用 ,将全长的番茄LeEIL2基因以反义方向构建到植物表达载体 pBI1 2 1上 ,经过酶切鉴定正确后 ,将该载体转入农杆菌EHA1 0 5中 ,通过农杆菌介导法转化番茄 ,经组织培养和抗性筛选获得再生植株 ,PCR检测再生植株 ,初步鉴定为阳性植株 ,为获得转反义LeEIL2番茄果实打下基础。