丁香假单胞菌中六个致病变种的全细胞蛋白质电泳分析

 利用聚丙稀酰胺电泳技术首次对丁香假单胞菌中6个致病变种全细胞蛋白电泳,发现同一致病变种内菌株蛋白条带一致,不同致病变种之间存在差异.以往对丁香假单胞菌中致病变种的鉴定方法主要是根据致病性的差异,结合营养筛选和血清学方法来进行.对丁香假单胞菌的6个致病变种的全细胞蛋白分析表明:全细胞蛋白质电泳能成功地鉴定到致病变种.     

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究

为研究丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000甘油激酶(Glycerol kinase,GK)的功能,根据Gen Bank中登录的Pst DC3000 GK氨基酸序列设计引物,克隆了Pst DC3000 GK基因,对其生物信息学特征进行分析,然后构建了GK基因敲除突变体,探讨其对菌体生理特性的影响。序列分析表明,GK基因全长1 506 bp,可编码一条501个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,Pst DC3000 GK蛋白分子质量55.8 ku,等电点5.54,富含无规卷曲结构。敲除Pst DC3000 GK后,可降低菌体在基本培养基与丰富培养基中的生长速率,增加细胞中甘油含量,同时也使菌体在拟南芥叶片上的增殖能力降低。因此,Pst DC3000 GK基因参与调控菌体的生长过程,影响菌体甘油代谢。     

丁香假单胞大豆致病变种不同HrpZ蛋白差异区域功能研究

[目的]丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株编码产生的Hrp Z蛋白差异序列主要集中在C端的3个区域,并且这2个蛋白诱导非寄主HR的能力也存在差异。本研究将探究Hrp Z蛋白这3个差异区域在烟草上诱导HR(hypersensitive response)和抑制烟草花叶病毒(TMV)中所起的作用。[方法]采用常规PCR及重叠PCR方法将这2个hrp Z基因的3个差异区域分别进行互换,构建了相应的重组表达载体,表达并纯化得到了6个重组蛋白,相对分子质量均在41×103左右。并检测了其诱导HR活性、诱导植物抗病性。[结果]检测结果表明:重组蛋白Hrp ZS(S2→A2)和Hrp ZA(A3→S3)诱导HR的能力相比亲本都有所增强,6个重组蛋白诱导烟草抗TMV的活性都明显强于亲本,其中,Hrp ZA(A3→S3)和Hrp ZS(S3→A3)的活性最强。[结论]此试验表明Hrp Z蛋白的这些差异区域(第7、8、9个α-螺旋)是过敏反应能力的主要调控区域,同时C-端第8、9个α-螺旋区域与诱导植物抗病性也显著相关。本研究为改造Hrp Z类harpin蛋白激发子,提高其诱导抗性及功能域研究提供了理论依据。     

丁香假单胞菌的分子生物学研究进展

丁香假单胞菌是好氧、腐生性强的革兰氏阴性菌,所引起的植物病害发生率位居十大细菌性植物病害之首,尤其引发的疫病在各农业大国爆发并有在世界范围扩散的趋势,给各国农业生产造成巨大的经济损失。基于国内外学者最新的分子生物学研究报道,对丁香假单胞菌的致病变种、病原菌鉴定、植物检疫、早期快速检测技术、致病机制及生物防治等方面进行综述,并探讨现阶段该病害研究存在的问题以及未来的研究方向与防治方案。     

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。     

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO₂浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶（β- carbonic anhydrase,βCA）是植物CO₂感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄（Solanum lycopersicum）等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network 数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型（wild-type,WT）番茄‘Ailsa Craig’（AC）为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000）,利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株（OE-SlβCA3）。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2 100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工（糖基化）,氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。     

EAV探针产生鸡DNA指纹图谱研究

以禽内源性反转录病毒片段（ＥＡＶ）为探针，成功地得到了ＳＲ９２Ａ系（♂）与萧山鸡（♀）杂交一代群体的ＤＮＡ指纹图谱，采用的限制性内切酶为ＥｃｏＲⅠ。结果表明：该探针在这种杂交群体中能检测１７个清晰可辨的指纹条带，这些条带在试验鸡群中的频率从０．２９～１．０不等，个体携带条带总数也存在着从１０～１６的变异，从而为研究ＥＡＶ－ＤＮＡ指纹与这种杂种群体生产性能之间的相关性提供了可能。     

丁香假单胞菌在3种苔藓中的致病性研究

【目的】探究细菌性病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)对2种荒漠耐干苔藓以及1种模式苔藓的致病性,为苔藓—病原菌互作模式的构建提供参考,并为抗病基因的筛选提供思路。【方法】选用2种荒漠耐干苔藓——齿肋赤藓(Syntrichia caninervis)和银叶真藓(Bryum argenteum)以及1种苔藓模式种——小立碗藓(Physcomitrella patens),通过形态学观察和植物抗病指标检测分析丁香假单胞菌在3种苔藓中的致病性以及3种苔藓的响应。【结果】丁香假单胞菌侵染苔藓后,随着接种时间的增加,苔藓细胞死亡量增加,死亡细胞多集中在病害发生区域。过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子原位染色结果表明：丁香假单胞菌入侵会造成3种苔藓发生免疫反应,且随着接种时间的增加,H₂O₂和超氧阴离子产生量增多,并以发生病斑及萎蔫植株中的含量最高。荧光定量PCR结果表明：3种苔藓体内的丁香假单胞菌病原菌数量与接种时间呈正相关。【结论】供试的3种苔藓可被丁香假单胞菌成功侵染,表现为出现细...     

烟草野火病病原菌对农用链霉素的抗药性测定

为合理防治烟草野火病,减少抗药性产生,减少农药残留,从云南省8个地州分离烟草野火病菌菌株43个,并就分离菌株对农用链霉素的抗药性进行了测定,结果表明,供试43个菌株中高抗菌株8个,中抗菌株比例较高17个,低抗菌株18个。不同来源的烟草野火病原菌株的抗药性存在差异,文山、昆明的菌株抗药性最高,红河菌株抗药性最低,抗性倍数最高达2000多倍,其余地州抗药性居中。不同地州分离菌株高、中、低抗菌株的比例存在明显差别。分离自文山邱北县双龙营镇的25#菌株抗药性最强,抗性倍数达45907.75,来自文山砚山县阿猛镇租白村的34#菌株抗药性最低。43株烟草野火病菌菌株对农用链霉素的EC50值平均为4.65,范围在0.004～183.631。高、中、低抗菌株的平均抗性倍数分别为6124.69、49.72、6.40。     

番茄细菌性斑点病病原鉴定的初步研究

1997～2001年在辽宁省的露地及大棚番茄上分离得到4个菌株,接种番茄幼苗上,发病症状与自然发病症状完全一致,并从接种病株上重新分离到此病原细菌,经革兰氏染色、菌体形态、培养性状、生理生化反应等鉴定,确认该病原菌为丁香假单胞番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato（Okabe）Young,Dye＆Wilkie）.     

Pear Blossom Blast Caused by Pseudomonas syringae pv.syringae in China

This study was done to determine the causal organism of the pear blossom and bud blast in China. It was identified by a bacteriological test, electro-microscopic observation, Koch＇s postulate test, Biolog, fatty acid methyl esters （FAMEs）, and a polymerase chain reaction （PCR） test, and compared with the standard reference strains. Six representative strains out of 20 pathogenic bacterial isolates from 16 diseased samples showed characteristics similar to three standard strains of Pseudomonas syringae pv. syringae from Belgium. They were identified as P. syringae pv. syringae with a Biolog similarity of 0.57-0.86 and FAMEs similarity of 0.58-0.81. The bacterium was reisolated from the symptomatic plants and blossoms. Identification as P. syringae pv. syringae was confirmed by using PCR primers and sequence tests, and compared with the above-mentioned results. The data supported the fact that the pear blossom and bud blast in China could be caused by P. syringae pv. syringae.     

桑黑枯型疫病防治新药剂的开发与应用

近几年桑黑枯型疫病在江苏盐城市的蚕桑重点乡镇暴发为害。本试验用已筛选出对桑黑枯型疫病有较好抑制作用的抗菌素进行了开发应用研究。结果表明,安全有效药剂应首选盐酸环丙沙星,其次为盐酸恩诺沙星。使用药剂的经济有效浓度为100 mg/kg,最低有效浓度为12.5 mg/kg,药剂间复配未见有增效作用。用中性偏碱的沟渠中蓄存水稀释药剂,降低防治效果。用喷施两种抗菌素的桑叶喂蚕,未见有叶质降低现象。通过在防治适期内喷施100 mg/kg的盐酸环丙沙星、盐酸恩诺沙星等药剂,配合其它农业防治措施,在盐城市的3个蚕桑重点乡镇的4个中试点上近100 hm2桑园有效地控制了危害。     

猕猴桃溃疡病菌噬菌体的初步研究

以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为指示菌,从猕猴桃溃疡病病枝中分离到一株噬菌体,对该噬菌体进行了热稳定性、pH值稳定性、紫外线稳定性、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性的测定。结果表明:噬菌体的热稳定性较弱,在65℃下10 min内即可全部失活;在pH值4~9的范围内噬菌体均可稳定存在;紫外线下照射12 min,噬菌体几乎全部失活;噬菌体的最佳感染复数为0.1;感染指示菌的潜伏期约60 min,爆发期约70 min,烈解量为123。这是首次关于猕猴桃溃疡病菌噬菌体的报道。     

云南烟草野火病病原细菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)鉴定

 对云南省各大烟区烟草叶片上引起褪绿晕圈的病原细菌从形态学、培养性状、生理生化反应、抗菌素反应、抗血清反应、遗传性状等方面进行了鉴定。结果表明:该菌为烟草野火病菌［Pseudomonas syringae pv. tabaci Wolf &; Foser (1917) Young, Dye &; Wilkie (1978)］。     

大豆细菌性斑点病菌生理小种的研究

采用室内幼菌接种鉴定的方法，确定了大豆品种十胜长叶、长农4号、丹豆4号、早丰3号、吉林28号和亚特1号为大豆细菌性斑点病菌生理小种的鉴别寄主，并由这6个鉴别寄主将我国大豆细菌性斑点病菌确定为14个生理小种，依次命名为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14。     

猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定

为明确猕猴桃细菌性溃疡病致病菌种类与特征,以从安徽岳西、陕西户县和重庆黔江等猕猴桃主产区收集到的溃疡病感染枝条和树皮为材料,采用平板划线、梯度稀释和BPA培养法分离病原物,采用烟草过敏性反应和猕猴桃健康叶片接种观察其致病性,结合特异引物扩增的16S-23SrDNA-ITS序列分析,对病原菌种类进行分子鉴定。结果表明:从收集的溃疡病感染枝条和树皮中,共分离纯化得到10株分离物;所有分离物均可使烟草叶片产生过敏反应,猕猴桃叶片接种显示同一菌株对不同品种及不同菌株对同一品种的致病力均存在差异。对特异扩增得到的280bp 16S-23SrDNA-ITS序列进行Blast比对分析,结果表明:10个菌株为同一致病菌,其DNA片段大小和序列均与丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae)完全一致。据此可以确定,试验分离所得的菌株均为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病变种。     

引起梨花枯和芽枯的Pseudomonas syringae pv.syringae 病原细菌鉴定

 【目的】明确在中国发生的梨花枯和芽枯的确切病原菌。【方法】用普通细菌学方法、电镜观察、Koch氏病原假说测定、Biolog、脂肪酸分析、PCR及与标准对照菌株的比较。【结果】从16个病样中分离获得12菌株,6株代表菌株显示出与Pseudomonas syringae pv. syringae 3株标准对照菌株相似的致病反应,它们的Biolog和脂肪酸分析的相似度分别为0.57～0.86 和0.58～0.81,PCR和序列测定结合上述结果证实了P. syringae pv. syringae为该病的病原菌。【结论】首次证实了中国梨树上的花枯和芽枯可由P. syringae pv. syringae引起。     

不同烟草品种对云南烟草野火病菌的抗性鉴定

采用采自云南省不同地点、不同生理小种的24株烟草野火病菌对24个不同烟草品种及两个野生种黄花烟和长花烟进行抗病性鉴定分析。结果表明，不同抗性品种对不同生理小种的抗性反应差异显著，根据接种后不同烟草品种的形成的病斑直径，将其划分为4个等级：高抗、中抗、中感、高感。辽烟15，G28对于烟草野火病菌0，1号生理小种均表现为高感，而云南省大面积栽培的K326、红花大金元、云烟87等对于两个生理小种均表现为中感，而两个野生种黄花烟和长花烟均表现为高抗，可以作为烟草野火病抗性育种优先利用的种质资源。