斑节对虾增殖细胞核抗原基因克隆及表达分析

为研究增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的功能,利用RACE技术克隆得到了斑节对虾PCNA基因(PmPCNA)的cDNA全长序列。该序列全长978 bp,包括135 bp的5′非编码区(5′UTR)、60 bp的3′UTR和编码260个氨基酸的783 bp的开放阅读框(ORF)。同源性分析结果表明,PmPCNA与其他物种具有很高的蛋白同源性。组织表达模式分析表明,PmPCNA在所监测的各组织中为组成性表达,其中在卵巢和脑中表达量较高;卵巢发育不同阶段基因的表达分析则表明PmPCNA在Ⅲ期表达量最高,是其他各期表达量的2倍;注射五羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)后,PmPCNA在卵巢中表达量明显上升,其中在48 h表达量升高幅度最大,是对照组的5倍左右。利用原核表达技术获得了PCNA的体外重组蛋白,Western Blot分析证实该重组蛋白为PCNA蛋白。以上研究结果表明,PmPCNA蛋白是斑节对虾卵巢发育过程中的重要调节因子,本研究为进一步认识斑节对虾卵巢发育机制提供了基础资料。     

斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析

从构建的斑节对虾（Penaeus monodon）肝胰腺转录组数据中筛选出泛素核糖体融合蛋白UbS27基因（ubiquitin/ribosomal S27 fusion protein,PmUbS27）片段,利用SMART-RACE技术克隆出PmUbS27基因cDNA全长,并利用软件对其结构进行分析;利用实时荧光定量技术检测PmUbS27基因在斑节对虾不同组织及卵巢不同发育期的表达情况。结果显示,PmUbS27基因cDNA全长为514 bp,开放阅读框465 bp,编码154个氨基酸,含有泛素（1~72 aa）和核糖体蛋白（101~147 aa）2个结构域。以DNA为模板克隆得到的基因序列由3个内含子和4个外显子组成。实时荧光定量结果显示,PmUbS27基因在斑节对虾各组织中均有表达,但是在卵巢中表达量最高,其次为肝胰腺、血淋巴和精巢。PmUbS27在卵巢发育前期（Ⅱ期）和成熟期（Ⅴ期）的表达量显著高于其他各期（P0.05）。结果表明,PmUbS27参与斑节对虾卵巢发育的过程并可能在卵巢发育进程中起到重要的调控作用。     

斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析

真核生物的转录调控多发生在转录的延伸阶段,细胞周期蛋白T（cyclin T）是细胞转录的重要调控因子。文章利用RACE技术获得斑节对虾（Penaeus monodon）Cyclin T (Pmcyclin T) cDNA全长,其全长为3 421 bp,其中开放阅读框 （ORF）3 135 bp,编码1 044个氨基酸;生物信息学分析显示,该氨基酸序列含有一个周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区,并含有N-糖基化位点和磷酸化位点;经BLAST同源性分析显示,细胞周期蛋白T编码的蛋白与柑橘木虱（Diaphorina citri）、切叶蚁（Acromyrmex echinatior）等多种节肢动物有很高的同源性;利用qRT-PCR技术对细胞周期蛋白 T在不同组织及卵巢发育各时期的mRNA水平的表达谱进行了研究。结果表明,细胞周期蛋白 T在斑节对虾的心、卵巢等7个组织中均有表达,其中卵巢中表达量显著高于其他组织（P0.05）;在卵巢发育各时期中,细胞周期蛋白T在Ⅲ期表达量最高。     

斑节对虾细胞周期蛋白E基因的克隆与表达分析

为了解细胞周期蛋白E(cyclin E)基因在斑节对虾(Penaeus monodon)发育过程中的作用, 构建和测序了斑节对虾全组织cDNA文库, 获得了斑节对虾细胞周期蛋白(Pmcyclin) E的部分表达序列。通过RACE技术克隆得到1条全长1 706 bp的cDNA序列。Pmcyclin E开放阅读框(ORF)为1 263 bp, 编码420个氨基酸。生物信息学分析表明, 该氨基酸序列含有周期蛋白家族特有的CYCLIN保守区并含有N-糖基化位点及磷酸化位点。经BLAST同源性分析表明, 该基因编码蛋白与红火蚁(Solenopsis invicta)、切叶蜂(Megachile rotundata)等多种节肢动物细胞周期蛋白E有很高的同源性。组织分布分析表明, 该基因在斑节对虾精巢、卵巢、肠、脑、肝胰腺、胃和心脏组织中均有表达, 其中卵巢中表达量较高, 而心脏、胃及肝胰腺中表达量相对较低。分别对蜕皮抑制激素(MIH)注射和眼柄切除的对虾进行表达分析, 发现眼柄切除后, Pmcyclin E大量表达, 而注射MIH后细胞Pmcyclin E的表达量相对降低。结果表明, 细胞cyclin E基因在斑节对虾卵巢发育过程中起重要作用, 且眼柄切除对细胞cyclin E的表达具有影响, 该结果为进一步探究斑节对虾卵巢的发育机理提供了理论依据。

     

斑节对虾含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因全长克隆及表达分析

为了研究含硒谷胱甘肽过氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase,SeGPx)在斑节对虾应激反应和卵巢发育中的作用,实验以斑节对虾肝胰腺转录组数据中筛选获得的Se-GPx基因(Pm Se-GPx)片段为基础,利用RACE技术获得Pm Se-GPx基因的c DNA全长,并对其进行了生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究了Pm Se-GPx在斑节对虾不同组织、卵巢发育各期、肝胰腺组织在pH9、硫酸铜(Cu~(2+))应激下的相对表达量和变化趋势。结果显示,Pm Se-GPx基因c DNA全长为959 bp,5'非编码区(UTR)长10bp,开放阅读框(ORF)长639 bp,编码212个氨基酸,310 bp的3'UTR包含一个硒代半胱氨酸插入序列(SECIS),ORF中的密码子209TGA211编码硒代半胱氨酸(selenocysteine,U67)。实时定量PCR实验结果表明,Pm Se-GPx在斑节对虾的肝胰腺、卵巢、精巢、心脏等组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量显著高于其他组织,卵巢次之;卵巢发育阶段表达结果则显示Pm Se-GPx在卵巢发育各期均有表达,在卵巢Ⅲ期表达量最高,其次是V期;在Cu~(2+)胁迫下,其表达量总体呈现先下降后上升然后又下降的趋势;在环境pH为9胁迫下,表达趋势呈现先下降,后回升,然后又下降,再大幅上升的趋势。研究表明,SeGPx在斑节对虾卵巢发育过程中具有重要作用,且Se-GPx参与斑节对虾对环境理化因子应激的免疫调控。     

斑节对虾组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析

通过克隆得到斑节对虾（Penaeus monodon）组织蛋白酶L基因（PmCatL）cDNA全长。该基因序列全长1 850bp,包括1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸。预测的PmCatL蛋白由信号肽(Met¹-Ala¹⁸)、前体域(Val¹⁹-Gln¹²³)和成熟域(Leu¹²⁴-Val³⁴¹)三部分构成,存在3个半胱氨酸蛋白酶活性位点(Cys¹⁴⁸、His²⁸⁷、Asn³⁰⁸)和1个潜在的糖基化位点(Asn⁹⁹)。具有组织蛋白酶L的E⁴⁵X₃RX₃FX₂NX₃IX₃N⁶⁴和G¹⁸⁷CXGG¹⁹²保守序列。同源性分析显示,PmCatL氨基酸序列与其他物种相似性为36%⁷5%。进化树显示PmCatL和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）亲缘关系最近,并与其他无脊椎动物的组织蛋白酶L聚成一支。表达结果表明,PmCatL基因在肝胰腺、淋巴、肌肉、性腺等被测组织中均有表达,其中淋巴和肝胰腺的表达量较高;PmCatL基因在斑节对虾仔虾时期表达量较高,可能与斑节对虾在这一时期的生长发育相关;PmCatL在卵巢发育的Ⅳ期表达量最高,可能在斑节对虾的卵巢发育中发挥重要作用。 

     

斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析

细胞分裂周期蛋白42 (CDC42)是一类广泛表达的小三磷酸鸟苷 (GTP)酶,是Ras家族内Rho亚家族的成员之一,具有GTP酶活性。CDC42在细胞吞噬和炎症发生等先天免疫中发挥着不可替代的功能。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾(Penaeus monodon)细胞分裂周期蛋白42 (PmCDC42)基因cDNA全长。生物信息学分析结果表明PmCDC42全长2 233 bp,包括59 bp的5' 非编码区 (UTR)、1 598 bp的3'UTR和576 bp的开放阅读框 (ORF),编码191个氨基酸。通过实时定量PCR技术,研究了PmCDC42在斑节对虾各组织的表达模式,并研究了其在不同pH、盐度、重金属镉(Cd)和哈维弧菌 (Vibrio harveyi)胁迫下的表达情况。结果显示,PmCDC42基因在各组织中均有表达,在血淋巴中的表达量最高。在pH和Cd胁迫下PmCDC42表达量显著升高;在高盐胁迫下PmCDC42表达量上调,低盐胁迫下PmCDC42表达量变化不显著;在哈维弧菌的刺激下PmCDC42上调表达极显著。这表明PmCDC42在斑节对虾先天免疫中起重要作用。     

野生斑节对虾卵巢发育过程中不同组织的氨基酸组成

测定了海南岛南部海域野生斑节对虾（Penaeus mofbodon）亲虾在卵巢发育不同阶段的全虾、肝胰腺和卵巢的氨基酸组成。结果表明,在卵巢发育初级阶段（含I期和Ⅵ期）、中级阶段（含Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）和高级阶段（V期）斑节对虾全虾样品中,牛磺酸（Tau）质量分数差异显著（P〈0．05）,由高到低为中级阶段〉高级阶段〉初级阶段;而其他的氨基酸质量分数、氨基酸总量和必需氨基酸总量略有变化,但差异不显著（P〉0．05）。肝胰腺和卵巢氨基酸总量随着性腺发育逐渐上升,临产时（V期）下降,但差异不显著（P〉0．05）。中级阶段卵巢中的天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）和赖氨酸（Lys）等5种氨基酸质量分数处于峰值。     

斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析

Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的c DNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5’非编码区(UTR)为89 bp,3’UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P<0.01),但在鳃中的表达被抑制(P<0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。     

斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析

该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,Pm GLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。