猪痘病毒江西株(SWPV-JX01株)的分离鉴定

本试验利用PK15细胞从江西省某猪场疑似猪痘的保育猪皮肤痘痂中分离到1株病毒,该分离毒株在PK15单层细胞上能连续盲传培养,不产生明显的细胞病变,通过PCR扩增猪痘病毒P35基因,扩增序列与猪痘病毒参考株(AF410153.1)P35基因的核苷酸同源性为97.9%,表明该分离病毒为猪痘病毒,并命名为SWPV-JX01。将SWPV-JX01株F5代细胞培养液经肌肉和皮下注射感染兔和小鼠,人工感染80 h后,通过PCR检测不同组织的猪痘病毒P35基因,从兔的肾脏、脾脏、皮肤、心肌、淋巴结均能扩增到P35基因,且扩增序列与SWPV-JX01株同源性为100%。试验结果表明,SWPV-JX01株能在兔体内增殖,但不能在昆明鼠体内增殖。     

猪痘病毒江西分离株JX08的分离鉴定

采用PK15细胞培养,对江西省某猪场疑似猪痘的病猪皮肤丘疹进行病毒分离,分离到1株猪痘病毒,命名为SWPV JX08,。根据猪痘病毒基因组序列设计了5对引物,对分离毒株进行TK基因、P35基因、P23基因、TK基因上游和下游片段分别进行PCR扩增,扩增片段与GenBank收录的猪痘病毒(AF410153.1)的核苷酸序列的同源性分别为97.5%、98%、98.6%、98.2%和98%。该分离毒株不但能使PK15细胞产生稳定的细胞病变,还能适应非猪源性的Vero细胞,并产生细胞病变;电镜下可见感染的PK15细胞内形成椭圆形或圆形的包涵体,胞浆中有大量椭圆形、砖形的典型猪痘病毒粒子,病毒粒子中央为哑铃状芯髓,病毒粒子大小为(244³40)nm×(164340)nm×(164²63)nm。该毒株皮下或静脉接种25日龄仔猪,感染7263)nm。该毒株皮下或静脉接种25日龄仔猪,感染7¹1d后,表现典型猪痘的症状(皮肤出现丘疹),其血清中可检测到SWPV抗体。     

保育猪发生猪痘的诊断及病毒分离

江西某猪场的部分保育猪皮肤出现数量不等的痘斑,为确定其病原,根据猪痘病毒(AF410153.1)设计1对引物,以该场发病猪的皮肤痘痂提取DNA,采用PCR的方法扩增出与预期大小相符的目的条带,测序结果表明该扩增片段为猪痘病毒核酸序列,与猪痘病毒参考毒株(AF410153.1)的同源性为98%。利用PK15细胞盲传从病猪皮肤痘痂中分离到一株猪痘病毒,该分离株在PK15细胞上不产生细胞病变(CPE)。采用间接ELISA方法对该场的24份猪血样进行猪痘病毒抗体检测,结果猪痘抗体阳性血清数12份(阳性率50%)。     

绵羊痘病毒山东流行株的分离鉴定与T4肽基因序列分析

从山东东营疑似绵羊痘病羊的肺脏组织中分离到1株病毒。取疑似绵羊痘病羊组织病料研磨、冻融、离心后分别接种11日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜和牛睾丸继代细胞,鸡胚接种部位出现明显的痘斑;牛睾丸细胞出现聚集、变圆等明显的细胞病变。利用1对绵羊痘病毒T4肽基因特异性引物进行了PCR扩增,获得与预期大小一致的约300 bp的片段。将所得序列与GenBank收录的绵羊痘病毒、山羊痘病毒等毒株相关序列进行比较分析。结果表明,该分离株与国外其他绵羊痘病毒株具有较高的同源性,达97.4%～99.3%;与山羊痘病毒株同源性为96.4%。通过试验初步证明所分离的病毒为绵羊痘病毒,并将该毒株命名为绵羊痘病毒DY株。     

绵羊痘病毒HB株的分离鉴定

从华东感染的绵羊中分离到一株病毒,命名为HB株。根据已发表的绵羊痘病毒的基因序列设计了一对引物,采用PCR方法从病毒HB株总DNA中扩增出与预期大小相符的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD-18T载体中,经Amp和蓝白斑筛选和PCR鉴定后,对阳性克隆株进行了序列测定和序列分析。扩增所得的HB株的基因片段与已发表的绵羊痘病毒毒株的相应基因片段具有高度同源性,同源性在99.5%~100%。研究结果证实分离毒株为绵羊痘病毒。     

江西部分地区猪痘病毒PCR检测及P35基因的分析

为了解江西部分地区猪痘病毒(SWPV)的感染及流行情况,从江西省7个地区(市)共36个规模化猪场采集55份疑似猪痘病猪的皮肤痘痂组织,应用PCR方法对其进行猪痘病毒核酸检测,并随机挑选19个PCR产物进行序列测定和P35基因序列分析。结果表明,55份样品中,有44份样品检测为SWPV阳性,阳性率高达80%;所测的19条序列与SWPV参考毒株(登录号:AF410153.1)P35基因核苷酸同源性为96.3%～98.4%,推导的氨基酸同源性为87.5%～88.5%;各序列之间的核苷酸同源性为97.7%～100%,推导的氨基酸序列同源性为98.2%～100%。结果表明江西省部分地区的猪群中存在猪痘病毒感染。     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒（FWPV）株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞（CEF）和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为（258~344） nm×（153~238） nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV（登录号：NC_002188.1）核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

猪巨细胞病毒GX株gB基因的克隆与序列分析

从广西病猪的肺组织中分离到猪巨细胞病毒GX株,通过PCR扩增得到猪巨细胞病毒GX株gB基因的一个1736bp片段,扩增产物经克隆、测序,得到的核苷酸序列与GenBank上已发表的猪巨细胞病毒其他分离株的核苷酸序列相比,其同源性在97.8%～98.9%,与人巨细胞病毒分离株的同源性在32.0%～43.6%,表明gB基因在同种动物间比较保守。在系统进化树中,GX株与其他猪巨化细胞病毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而与人巨化细胞病毒差异较大。     

鸡痘病毒FJ01株的分离鉴定

为调查福建规模化养鸡场病鸡的死亡原因,试验以福建省送检的鸡冠及头部皮肤有大量结节状痘痂的病鸡病料为研究对象进行了PCR鉴定。初步鉴定为鸡痘病毒(FWPV)株后,通过接种鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分离病毒;用原代鸡胚成纤维细胞(CEF)和传代细胞DF-1细胞对病毒进行传代,观察该分离毒株在两种细胞上培养特性的异同;对被感染的CEF进行超薄切片观察病毒的分布及病毒粒子的形态;并针对该分离株的TK基因和FPV175基因序列进行同源性分析。结果显示,接种经抗生素处理后的病料匀浆液上清的CAM出现大面积单个白色隆起的痘斑,匀浆痘斑后同时接种CEF和DF-1细胞,两种细胞均能产生稳定可持续传代的细胞病变,但病变出现的时间及病变程度不同;透射电镜下观察到典型的FWPV粒子密集分布在CEF的胞浆中,清晰可见卵圆形外膜包裹着的两侧凹陷的核心。对其中23个病毒粒子进行统计测得病毒粒子的大小为(258～344) nm×(153～238) nm;针对FWPV TK基因和FPV175基因的PCR检测及测序结果与GenBank收录的FWPV(登录号:NC_002188.1)核苷酸序列同源性分别高达100%和99.8%。以上结果表明该分离毒株为FWPV,命名为FWPV-FJ01,为国内FWPV的防治提供了参考依据。     

鸽痘病毒的分离鉴定及病理组织学观察

为确诊福建省某规模肉鸽养殖场疑似鸽痘疫情,采集病鸽皮肤痘痂组织,经处理后接种11日龄SPF鸡胚,培养7d后观察到鸡胚尿囊膜增厚,出现典型的白色痘斑。组织学观察可见皮肤表皮增生,形成厚的网状结构,上皮细胞呈不同程度的空泡变性,胞浆内有嗜酸性包涵体,呈红色、圆形或椭圆形;肺脏淤血,肺泡破裂及增殖性支气管炎。待检样本进行鸽痘病毒P4b基因PCR检测,得到特异性条带;根据P4b基因核酸序列构建系统发育树,结果显示分离株与来自美国(KC017965)和南非(KJ801920)的2株鸽痘病毒聚在一起,同源性为100%,与企鹅痘病毒、鹌鹑痘病毒和鸡痘病毒的同源性分别为99.6%,99.6%和91.1%;与金丝雀痘病毒和火鸡痘病毒同源性最低,为73.3%～75.0%。结果表明,本次暴发为鸽痘病毒感染所致,为鸽痘防控及致病机理研究奠定了理论基础。