家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质双向电泳及质谱鉴定

家蚕幼虫头部有单眼、触角、口器、脑等取食和感觉的中心器官及坚硬的外壳。提取家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质进行双向电泳,经银染检测到654个蛋白点,这些蛋白的分子质量主要分布在15～97 kD之间,等电点(pI)在4～8之间;在pH 3～4和9～10的区域,也有较多的蛋白质被检测到,但该区域高丰度的蛋白质数量较少。对丰度较高的100个蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,有52个蛋白质被鉴定,其中有21个酶类相关的蛋白,占被鉴定总蛋白质数的40.4%,其它蛋白质主要包括表皮蛋白、气味结合相关蛋白、肌肉相关蛋白等。研究结果可为家蚕幼虫头部组织的功能分析提供蛋白质水平的信息数据。     

家蚕孤雌生殖系与有性生殖系亲本的血液比较蛋白质组学研究

为进一步解析家蚕孤雌生殖的发生机制,采用双向电泳(2-DE)、基质辅助质量飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)和生物信息学技术,对高发生率和高孵化率的家蚕孤雌生殖系与其有性生殖系亲本的血液蛋白质组成进行比较分析。较其有性生殖系亲本,孤雌生殖系幼虫在5龄第3天、第5天和第7天血液中的差异蛋白不完全相同。对6个持续表达和差异明显的蛋白进行质谱分析,成功鉴定其中2个蛋白分别是保幼激素结合蛋白和胰凝乳蛋白酶抑制剂-8A,推测这2个蛋白及其余4个未被鉴定出的蛋白与2种生殖方式家蚕品系的生长发育、生殖等过程的调节有关联。     

家蚕幼虫正常个体与眠性变化个体大眠蜕皮前后血液蛋白质差异表达分析

家蚕眠性既受染色体上主基因的控制,又受其它伴性成熟基因的调控,还受环境因素的影响。为了探讨环境因素改变家蚕眠性的分子机制,以四眠蚕品种898黄绿、D92黄绿和三眠蚕品种三眠A为材料,通过催青期或小蚕期温度、湿度、营养等因素的调控诱导眠性变化,利用双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)技术,对这些家蚕正常个体和眠性变化个体大眠蜕皮前后的血液蛋白质表达差异进行分析鉴定。结果共获得转铁蛋白、胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-I、多聚腺苷酸结合蛋白2、27 kD糖蛋白前体、核糖体蛋白L20和线粒体核糖体蛋白L2等13个上调或下调的可能与家蚕眠性相关的差异表达蛋白,为进一步从蛋白质水平深入了解家蚕眠性变化的机制奠定了基础。     

家蚕雌性附腺分泌蛋白的双向电泳分离及质谱鉴定

采用24 cm的双向电泳可以分离出家蚕雌性附腺分泌的70多种蛋白或多肽,其中有30多个蛋白或多肽的表达量较大。从这些蛋白斑点在凝胶中的分布位置上看,大多数分布在等电点pI 4~7的范围内,主要蛋白的分子量较大。对其中表达量相对较高的33个蛋白点进行胶内酶解后质谱分析,并根据检索到的蛋白质的功能进行分类,最多的是核糖体蛋白家族,占蛋白质总量的30.4%,另外还有2个热休克蛋白。除此之外,还有一些如RNA结合蛋白、转录延长因子等功能性蛋白质。这些蛋白质共同组成了具有特殊物理性质的分泌物。     

家蚕幼虫消化液蛋白质组学分析

为了研究家蚕幼虫消化液的蛋白质组成情况,用双向电泳(2-DE)技术对家蚕幼虫消化液中的蛋白质进行了分离,随后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对其中的8个高丰度蛋白进行了鉴定,并用生物信息学方法进行了分析。结果显示:家蚕幼虫消化液中的蛋白质种类较少,分子量小,分布集中;在8个鉴定的蛋白点中,1个是30kP蛋白酶A原,5个是类胰蛋白酶,其它2个是碱性丝氨酸蛋白酶。     

家蚕微孢子虫蛋白水解酶的活性检测及质谱鉴定和序列分析

微孢子虫的蛋白水解酶类不仅参与代谢活动,而且可能作为一种潜在的侵染宿主的毒力因子。为了研究家蚕微孢子虫蛋白水解酶的种类及蛋白质结构特点,将家蚕微孢子虫总蛋白经非变性凝胶电泳后与底物酪蛋白孵育,检测到可水解酪蛋白的蛋白酶类的活性。采用质谱法分析该类蛋白酶主要是锌离子依赖型的细胞质型亮氨酰氨肽酶和丝氨酸蛋白酶。细胞质型亮氨酰氨肽酶序列是由1 515个碱基编码的505个氨基酸组成,无信号肽,有2个潜在的锌离子结合部位,属于金属蛋白酶M17家族;丝氨酸蛋白酶具有肽酶S8结构域和跨膜域。通过序列比对发现在兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫中均有这2种酶,且相似度较高,其进化较为保守。     

家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种的中肠组织蛋白比较分析

为了探明家蚕对浓核病毒(镇江株)抵抗性和感受性品种间在分子机制上的差异,通过蛋白质双向电泳(2-DE)和基质辅助质量飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)对两个不同抗性家蚕品种的中肠组织蛋白进行了比较分析。2-DE电泳结果表明,两个品种间的中肠组织蛋白斑点数及位置、形态等差异很小,进一步比较获得了9个差异蛋白斑点,其中感受性蚕品种JS有6个,抵抗性蚕品种NIL有3个。经MALDI-TOF MS鉴定结果显示,感受性品种JS有4个差异蛋白斑点可能分别为氢离子转运ATP合酶β亚基1、氢离子转运ATP合酶β亚基2、组织蛋白酶D或3-羟酰辅酶A脱氢酶;抵抗性品种NIL中有2个差异蛋白点可能是组织蛋白酶。     

家蚕化蛹第7天卵巢组织蛋白质标准图谱的构建

家蚕蛹期是卵子发育的重要时期,对蛹期卵巢的蛋白质组学研究将有助于认识家蚕的卵子发育过程。获取处于卵黄生成期的家蚕化蛹第7天卵巢组织,提取蛋白样品进行双向电泳,经银染后检测到682个蛋白点,这些蛋白点主要分布于分子质量15-90 kD、等电点4-8之间。对其中较高丰度的蛋白点进行飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定,共分析得到40个可信蛋白点,其中包括4个在家蚕中新鉴定的蛋白。经基因功能分类分析,这些蛋白包括营养储存蛋白、应激相关蛋白、蛋白翻译相关蛋白及代谢相关蛋白等。     

农药氰戊菊酯和杀虫双诱导家蚕血液蛋白的变化

为了解析家蚕对常用农药氰戊菊酯和杀虫双的解毒机制,分别给家蚕5龄幼虫添食2种农药,观察家蚕对农药的中毒症状,采用双向电泳(2-DE)技术对添食农药的家蚕幼虫的血液蛋白进行分离,利用电喷雾电离(ESI)质谱对具有2次以上重复的显著差异蛋白点进行鉴定,并用生物信息学方法进行分析。家蚕5龄幼虫分别添食1/4LD50剂量浓度的2种农药后,均在3～12h内出现中毒症状,且血液蛋白的表达也发生了变化:在氰戊菊酯诱导下,幼虫血液中增加了纤维样蛋白、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂;在杀虫双诱导下,幼虫血液中增加了丝氨酸蛋白酶抑制剂-13;经2种农药分别诱导处理后3h,幼虫血液中都减少了体液低分子蛋白-Ⅲ的表达。推测家蚕对氰戊菊酯和杀虫双具有一定的免疫反应。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

家蚕中肠组织蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的中肠组织进行了研究,利用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,并采用GPMAW软件对家蚕基因组预测的蛋白质数据库进行了本地构库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。结果发现,家蚕中肠蛋白质经过双向凝胶电泳和图像分析,银染后可以检测出600个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量15～80 kD区域,等电点3～8.5之间。MALD I-TOF MS鉴定的36个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中32个蛋白点得到了成功鉴定,包括原肌球蛋白以及大量的离子转运蛋白、与代谢相关的酶、与信号传导和细胞凋亡相关的蛋白等。这一结果为进一步认识家蚕中肠组织的生理功能提供了基础信息。     

家蚕感染浓核病毒(镇江株)晚期的中肠和血液组织蛋白变化

为了进一步探明家蚕浓核病毒(镇江株)对家蚕的致病机制,通过蛋白质双向电泳技术对家蚕感染浓核病毒晚期的中肠和血液组织蛋白进行了分析。结果表明,感受性蚕品种在感染浓核病毒晚期,其中肠、血液组织蛋白量急剧下降,有近30%的蛋白点消失,其余蛋白点的含量也大幅下调达50%以上。由此说明由于浓核病毒侵染破坏了家蚕中肠上皮组织以及中肠的消化吸收功能,阻断了营养物质的输入,进而极大地减少了蚕体自身组织蛋白的合成。     

家蚕雌性附腺及其分泌物的蛋白质双向电泳分析

家蚕雌性附腺由分泌部和贮存部组成,化蛾前期分泌大量胶状粘液蛋白,产卵时胶状粘液蛋白将蚕卵固定在外界物质上。对雌性附腺分泌部及胶状粘液的蛋白质进行提取,并用双向电泳进行分离和分析,结果表明用裂解缓冲液可以得到丰度较高的蛋白质混合物,利用双向电泳技术可以获得高分辨率、高重复性的蛋白质图谱。     

家蚕突变矮小卵血液蛋白及卵黄蛋白的研究

对家蚕突变矮小卵 (emi)品种在卵母细胞形成时期的血液、卵巢及卵中的总蛋白进行SDS PAGE发现 :在emi的卵巢及卵中含有卵黄蛋白 (Vn)、卵特异性蛋白 (ESP)和大部分的低分子量脂蛋白 (LP) ;emi蚕在蛹期和蛾期的血液中有卵黄原蛋白 (Vg)和LP ,蛹后期大部分emi血液中的Vg和LP含量逐渐减少 ,化蛾时血液中仅含少量的Vg和LP ,而少数emi个体的卵母细胞大量退化 ,在蛹后期和蛾期血液中还含有大量的LP和较多的Vg ;emi蚕从吐丝当天到蛾期的血液中的LP中有分子量为 30kD的蛋白带 ,在卵中却没有。以上结果表明 ,emi基因可能不仅决定卵大小 ,还可能对LP的不同成分的吸收 (如不能吸收LP中分子量为 30kD的蛋白 )有关 ,推测这可能是导致emi个体大部分不能正常发育的原因之一     

中国野桑蚕和家蚕的AFLP分析

利用AFLP技术和统计学分析原理 ,对我国具有代表性的 10个不同地区野桑蚕和 33个家蚕品种以及 5个作为外群对照的柞蚕品种进行了分子系统学研究。研究结果表明 ,不同地区野桑蚕之间的遗传距离 (0 0 0 0～0 419)与家蚕品种之间的遗传距离 (0 0 0 0～ 0 40 6 )相似 ,而家蚕与野桑蚕之间的遗传距离为 (0 35 5～ 0 5 32 ) ,明显地小于家蚕与柞蚕 (0 76 1～ 0 86 5 )和野桑蚕与柞蚕 (0 776～ 0 839)之间的遗传距离 ,进一步证明了家蚕起源于中国野桑蚕。聚类分析发现 ,中国一化种与二化种聚类在一起 ,中国二化种与热带种聚类在一起 ,热带种不与一化种聚在一个类群 ,这一结果证明中国二化种在进化上介于一化种和热带多化种之间     

家蚕与中国野桑蚕的RAPD标记遗传多样性比较分析

对家蚕品种C10 8及江苏地区野桑蚕进行了RAPD分析 ,并利用已有的不同家蚕品种及其它地区野桑蚕的RAPD数据 ,比较了家蚕品种内和野桑蚕地理种群内个体间、家蚕品种间和野桑蚕地理种群间的遗传多样性。家蚕品种内的多态位点比率、Shannnon信息指数、Nei基因多样性指数等都远较野桑蚕地理种群内个体间的小 ,2 5个家蚕品种在分组和未分组时的遗传多样性指数仅有一组例外 ,其余均较野桑蚕地理种群间的大。由此说明家蚕品种内的遗传多样性比野桑蚕地理种群内个体间的低 ;而家蚕品种间的遗传多样性水平却比野桑蚕地理种群间的高。未分组家蚕品种间的遗传多样性指数略大于分组后的 ,表明分析比较的样本数不同对结果也有一定影响。