通用型流感疫苗研究进展

疫苗免疫是目前防控流感病毒感染最有效的策略。现有流感疫苗在不同亚型间的交叉保护力较差,并且由于HA和NA蛋白存在抗原漂移和转换现象,极大地影响了现有疫苗的免疫保护效果,甚至导致疫苗免疫失败。而动物模型研究结果显示,基于流感病毒基因组保守区域的疫苗能够对不同型或亚型的流感病毒产生广谱的交叉保护,本文主要介绍基于M2e、HA和NP的通用型流感型疫苗研究进展。     

美国研制新型动物流感疫苗

美国科学家正在开发的一种新型流感疫苗最近在动物实验中获得了令人鼓舞的结果。新疫苗基于流感病毒中相对稳定的部位设计成功,这也许有助于消除病毒变异给疫苗效力造成的影响。位于宾夕法尼亚州的威斯塔研究所的科学家介绍说,美国现有的流感疫苗采用了流感病毒中两个较大的外壳蛋白,主要通过这两个蛋白来刺激人体产生免疫反应。现有疫苗效果虽然不错,但问题在于其采用的病毒外壳蛋白变异速度很快,所以疫苗需要不断“升级”,才能赶上病毒变异的步伐。新型疫苗包含了一种利用基因工程手段制造的多肽。这种多肽能模拟流感病毒中名为M2的外壳…     

畜牧兽医科技文摘

<正>通用型流感疫苗研究进展/马继红(中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241),于海,童光志…//中国动物传染病学报.-2011,19().-76～82疫苗免疫是目前防控流感病毒感染最有效的策略。现有流感疫苗在不同亚型间的交叉保护力较差,并且由于HA和NA蛋白存在抗原漂移和转换现象,极大地影响了现有疫苗的免疫保护效果,甚至导致疫苗免疫失败。而动物模型研究结果显示,基于流感病毒基因组保守区域的疫苗能够对不同型或亚型的流感病毒产生广谱的交叉保护,本文主要介绍基于M2e、HA和NP的通用型流感型疫苗研究进展。     

A型流感病毒基质蛋白研究进展

流感病毒基质蛋白 MA包括 M1和 M2两种 ,在病毒进化过程中其结构是稳定的。 A型流感病毒 M1在病毒复制及感染中起关键作用 ,而 M2是一种跨膜蛋白 ,结构很保守。 M2可调节高尔基体跨膜转移通道的 p H梯度 ,对 HA蛋白起稳定性作用。将 M2与乙肝病毒制成融合蛋白 ( M2 HBc)分别免疫小鼠 ,小鼠获得了 90 %～10 0 %的免疫保护力 ,且具有交叉性和持久性。用研制的含 M2基因的 DNA疫苗 ,免疫小鼠产生了 M蛋白特异性的抗体和 CTL反应 ,并对流感病毒攻击具有保护力     

流感病毒 HA 受体结合位点抑制剂研究进展

目前临床所用控制流感病毒的药物和疫苗受到病毒耐药性、疫苗滞后性等诸多因素的限制,使能阻止病毒侵入宿主细胞的抑制剂成为当前研究的热点。唾液酸是流感病毒囊膜表面血凝素（HA）的受体,但研究表明唾液酸并不适合作为研制流感病毒侵入宿主细胞抑制剂的结构模型。研究发现流感病毒的HA 受体结合位点必须外露才能与宿主细胞受体结合,因此 HA 受体结合位点可以被宿主免疫系统监视,成为抗体潜在的靶向契合位点。随后发现的 HA 受体结合位点抗体能与 HA 受体结合位点的保守氨基酸残基结合,能有效阻止流感病毒感染宿主。因此,可用 HA 受体结合位点抗体作为流感病毒感染抑制剂的模型,研制流感病毒抑制剂。论文就流感病毒 HA 的分子结构和功能,HA 结合受体的机制,HA 受体结合位点抗体以及该类抗体对流感病毒的抑制效果进行了阐述,以期对以 HA 受体结合位点抗体为模型研制流感病毒感染抑制剂提供帮助。     

A型流感病毒M2蛋白研究进展

M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH.其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异.其25位～43位氨基酸多肽是金刚烷胺类抗流感病毒药物的作用靶位,氨基酸极小变异都可能导致流感病毒抗药性的产生.M2蛋白胞外区域的氨基酸残基多肽(M2e)的特异性抗体可以在感染流感病毒的动物血清中检测出来,将M2e与相关佐剂联合使用可极太的提高机体对流感病毒的免疫力,在病毒感染中起重要作用,是一种潜在的交叉保护性抗原,常被用来探索具有广谱性和持久性的流感"通用疫苗".     

一种共表达不同亚型禽流感病毒基因且形成病毒样颗粒的真核表达载体的构建与鉴定

动物流感DNA疫苗是非常有应用前景的新型疫苗之一,本研究构建了能同时表达禽流感病毒2种血凝素H5HA和H9HA以及1种神经氨酸酶N1NA的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明,构建的真核表达质粒转染MDCK细胞后,同时表达出H5HA、H9HA和N1NA蛋白;转染293T细胞上清通过血凝试验可检测到2~4血凝价;通过透射电镜观察到了病毒样颗粒。本研究用一种质粒同时表达不同亚型流感病毒蛋白并且形成了病毒样颗粒,为流感病毒多价DNA疫苗研究提供了坚实基础。     

应对高致病性禽流感病毒H5N1抗原漂移的通用疫苗策略

高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1不仅能造成严重的病理损伤,而且能够跨越种间隔离从禽类直接传播给人类,对人类健康造成巨大的威胁。疫苗免疫是应对HPAIV H5N1最常用的防控手段。但由于流感病毒具有抗原漂移和抗原转变的能力,只针对特定流行株的常规疫苗不能够有效的应对毒株的不断变异。研制能够激发广泛保护作用的通用疫苗是应对HPAIV H5N1抗原漂移的一种有力措施,该类疫苗以流感病毒中高度保守的蛋白结构域,如M2蛋白胞外域(M2e)、HA蛋白的茎部结构域以及其他的保守抗原表位为免疫原,激发机体产生广泛的保护以应对不断变异的流感病毒。论文主要对现阶段通用疫苗的研究思路及进展做一梳理,以期能够为禽流感疫苗的研制提供有益的帮助。     

H3N2亚型犬流感病毒头部缺失血凝素蛋白的真核表达及抗原性研究

为获得一种针对不同亚型流感病毒的共同保护性抗原,本研究以H3N2亚型犬流感病毒(canine influenza virus, CIV)的主要抗原蛋白血凝素(HA)为靶标,以四甘氨酸接头肽替换HA头部结构域,将免疫反应定向至更保守的HA茎部区,同时在HA茎部添加T4折叠三聚体以保护蛋白天然构象,通过杆状病毒表达系统表达头部缺失HA蛋白,并验证其抗原性。结果表明,利用昆虫细胞表达的头部缺失,HA蛋白单一性较好,分子量为47 ku,与CIV全病毒血清抗体可发生特异性结合反应,且头部去除区HA蛋白血清抗体可抑制H1N1和H3N2亚型流感病毒感染所致的细胞病变效应,中和效价分别为1∶160和1∶320。研究结果为制备针对不同亚型流感病毒(如H1N1和H3N2)的广谱疫苗提供了可能。     

血凝素蛋白稳定性对流感病毒生物学特性影响的研究进展

流感病毒(Influenza A virus,IAV)可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病,是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。当前主要通过疫苗接种的方式控制流感的流行,疫苗的开发研究仍然是防控工作的重点。IAV血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白是疫苗研制的主要靶标,HA蛋白是病毒粒子表面主要糖蛋白之一,介导IAV入侵,也是宿主免疫系统的识别对象。文章就IAV HA蛋白的稳定性影响病毒的复制能力、宿主范围、致病性和气溶胶传播能力等生物学特性的相关研究进行综述,探究流感病毒稳定性对疫苗优化的意义。     

噬菌体展示文库技术及在疫苗研制中的应用现状

噬菌体展示文库技术已成为高效表达筛选功能性蛋白的新一代技术,广泛应用于药物筛选及多肽疫苗研制等研究领域。现对噬菌体展示技术及其在疫苗研制中的研究现状作简要的综述。     

流感病毒M1蛋白与M2蛋白相互作用以及其在病毒出芽中的作用

流感病毒为囊膜病毒,以出芽的方式释放病毒。M1蛋白是流感病毒的基质蛋白,在维持病毒颗粒形态与病毒的致病性中发挥重要作用。M2蛋白是离子通道蛋白,在病毒出芽过程中发挥重要作用。研究显示M1蛋白与M2蛋白存在相互作用,但是这种互作在病毒出芽中的功能尚不清楚。根据M1蛋白的结构,M1蛋白分成N端、C端和中间区域3个区域,与M2蛋白相互作用的区域也不清楚。本文利用双分子荧光互补实验与病毒出芽实验方法研究了M1蛋白与M2蛋白互作的区域及这种互作在病毒出芽中的作用。研究结果显示,M2蛋白通过与M1蛋白的N端1~160个氨基酸相互作用,从而帮助M1蛋白出芽;M1蛋白的1~20氨基酸与140~160氨基酸在决定M1蛋白的稳定性与功能发挥中具有重要作用,缺失这2个氨基酸序列可导致M1蛋白N端1~160个氨基酸蛋白不稳定,并不能与M2蛋白互作。本研究揭示了3H1N1流感病毒M1蛋白与M2蛋白互作功能区域、以及他们之间相互作用在流感病毒出芽中发挥的重要作用。     

甲型流感病毒NP和M2的特性及其在疫苗研制中的应用

甲型流感病毒核蛋白(NP)为该病毒内部的单体结构蛋白,基质蛋白2(M2)是该病毒囊膜上具有非糖基化跨膜结构的离子通道蛋白,二者均具有高度保守的氨基酸序列并对流感病毒复制及适应宿主起着重要作用。由于传统甲型流感疫苗具有诸多缺点,越来越多的学者选取该病毒的保守序列研制新型通用疫苗。本文主要论述了NP和M2的特性以及相关通用疫苗的研究成果。     

一株H1N1亚型猪流感病毒血凝素HA蛋白中和性单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

为制备H1N1亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(HA)蛋白中和性单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究以纯化的H1N1 SIV全病毒免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选出一株稳定分泌抗H1N1 SIV HA蛋白的MAb杂交瘤细胞株(10H8)。MAb亚类鉴定结果显示其亚类为IgG2a。MAb 10H8细胞上清和腹水的IPMA效价分别为11 024和151 200,腹水血凝抑制(HI)效价为13log2。Western blot试验结果显示MAb 10H8能够特异性地结合HA蛋白。病毒中和试验结果显示MAb 10H8杂交瘤细胞培养上清原液和1640稀释的腹水均能够抑制H1N1亚型SIV感染细胞,对SIV具有较强的中和活性。HA蛋白合成多肽的dot-blot鉴定结果显示,MAb 10H8识别的线性抗原表位为295KCQTPHGALKGNLPFQ310。本研究为H1N1亚型SIV诊断试剂和新型疫苗研发奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒样颗粒疫苗的制备研究

目前,我国现有的商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒流行株的感染。病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗的免疫效果及其安全性优于灭活苗,成为近年研究的热点。本研究旨在建立一种H9N2亚型流感病毒VLP疫苗制备的方法。将优化的H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA基因和未优化的HA、NA基因分别插入到pFastBack~(TM)Dual载体中,得到相应的重组供体。然后将这些重组供体转化至含Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,获得含有目的基因的重组杆粒。将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞,红细胞凝集试验、SDS-PAGE和Western blot结果显示,优化的HA、NA基因编码的蛋白在Sf9昆虫细胞中获得了成功表达。通过透射电子显微镜观察细胞上清的浓缩液,能检测到VLP。结果表明,本研究在Sf9昆虫表达系统中成功表达了H9N2亚型禽流感病毒的HA和NA蛋白,并形成了VLP,为进一步研究该病毒VLP疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒结构蛋白VP2研究进展

猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一,目前该病在世界很多国家均有流行和报道,给养猪业带来巨大损失。传统的灭活苗和弱毒苗又都存在各自的缺陷,新型诊断试剂及疫苗的研究迫在眉睫。VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,具有在体外能自我装配成类病毒粒子,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,可作为抗原转运载体等特性,故VP2蛋白在猪细小病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有很大的潜力。论文就VP2的分子生物学及其在该病诊断与预防等方面的研究进展进行了综述。     

禽流感病毒A/duck/Fujian/31/2007(H5N1)株M1 基质蛋白的原核表达与免疫原性鉴定

经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750 bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,BCA法测定纯化蛋白的浓度为0.656 mg/mL,免疫印迹检测结果表明,纯化的重组蛋白具有良好的反应活性。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测结果表明,重组蛋白可产生抗M1蛋白特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究成功表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,且重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研制H5N1亚型流感病毒诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础。     

信息采撷

美国研制新型动物流感疫苗美国科学家正在开发的一种新型流感疫苗最近在动物实验中获得了令人鼓舞的结果。新疫苗基于流感病毒中相对稳定的部位设计成功。科学家说,这也许有助于消除病毒变异给疫苗效力造成的影响。位于宾夕法尼亚州的威斯塔研究所的科学家介绍说,美国现有的流感疫苗采用了流感病毒中两个比较大的外壳蛋白,主要通过这两个蛋白来刺激人体产生免疫反应。现有疫苗效果虽然不错,但问题在于其采用的病毒外壳蛋白变异速度很快,所以疫苗需要不断“升级”,才能赶上病毒变异的步伐。新型疫苗包含了一种利用基因工程手段制造的多肽。这…     

NA蛋白对流感病毒受体结合特性影响的研究

为研究两株H7亚型流感病毒A/chicken/Jilin/SD020/2014(H7N2)(简称JL/020)和A/Anhui/1/2013(H7N9)(简称AH/1)受体结合特异性差异的影响机制,本实验利用反向遗传操作技术,构建一系列重配病毒和HA基因点突变病毒,检测其对受体结合特性的影响。固相ELISA检测结果表明血凝素蛋白(HA)中的57和312位氨基酸不影响流感病毒的受体结合特性,而神经氨酸酶蛋白(NA)使r-JL/020(AH/1骨架)结合SAα2,3Gal受体的结合能力高于r-AH/1(R57K/R312K),表明NA影响了流感病毒受体结合特性;同源建模进一步发现HA中的57和312位点与流感病毒受体结合结构域相距较远;交叉血凝抑制试验(HI)结果表明,H7单因子血清和H7N9全病毒血清对拯救的JL/020和AH/1病毒株的抑制价没有差异,而N2单因子血清对病毒的抑制能力存在差异。以上结果表明,NA蛋白影响了流感病毒的受体结合特性。本研究表明,除HA以外,NA也能够影响流感病毒的受体结合特性,该实验为进一步研究流感病毒受体结合特性提供了实验依据。     

不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白的比较分析

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。