雪龙黑牛试管胚胎产业化生产培养方法的建立

为充分利用雪龙兼松屠宰场废弃的优秀母牛卵巢,加速雪龙黑牛培育进程,满足高档牛肉市场需求,本文对胚胎生产体外受精3个关键技术环节进行了试验研究,共做了15批次试验,包括卵母细胞体外成熟培养的试验研究,卵母细胞体外受精试验研究以及受精卵体外培养试验研究。结果显示,卵母细胞的成熟率达98.6%,卵裂率为86.5%,囊胚发育率为36.8%。初步建立了一整套雪龙黑牛试管胚胎产业化生产培养方法和技术。     

牛体外胚胎培养技术研究进展

为提高优秀淘汰牛的利用价值,国内外对牛体外胚胎培养技术做了大量研究,本文针对牛体外卵子获得方式、卵子体外成熟培养、成熟卵母细胞与冻精或性控冻精体外受精及受精卵体外培养发育到囊胚等关键技术的研究进展做一综述。     

用淘汰奶牛卵巢生产体外受精奶牛胚胎的研究

本文研究了淘汰奶牛卵巢采集方法、卵丘细胞和颗粒细胞对卵母细胞体外受精后发育的影响.结果表明奶牛屠宰后取其卵巢,用剖解法可比抽吸法得到更多的可用卵母细胞(8.5:6.2枚/卵巢,P＜0.05).经成熟培养和体外受精后,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞卵裂率为40.2%,但仅28.2%停留在8～16细胞期,最高发育阶段为16细胞期;而有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘-卵母细胞复合体,其卵裂率(60.2%:53.2%,P＜0.05)和囊胚发育率(31.5%:19.6%,P＜0.05)均高于卵丘细胞包被不全的卵母细胞.在培养液中添加颗粒细胞,提高囊胚细胞数(96.2±5.2:70.4±4.6,P＜0.05),但没有促进牛受精卵的卵裂率.     

卵丘细胞对辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索辽宁绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵丘细胞对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。试验1,将一部分COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(DOs),然后以4种方式培养,即COCs单独培养、DOs与COCs共培养(DOs(COCs))、DOs与卵丘颗粒细胞共培养(DOs(CCs)),以及DOs单独培养。试验2,根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组,有3层卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体COCs3,有1-3层卵丘细胞包围的卵母细胞COCs1-3,无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞NOs,3组各自单独培养。结果表明:COCs组的成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率最高,分别为83.25%、41.75%和29.25%,卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟和随后的发育,COCs3组成熟率、孤雌卵裂率和囊胚率分别为83.25%、42.50%和29.75%,显著高于COCs1-3和NOs组,卵丘细胞的完整性也影响着卵母细胞的体外发育,自然裸卵已失去体外发育能力。     

铁对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

本试验研究铁对体外生产牛胚胎的影响。从屠宰场收集牛卵巢,抽取卵巢表面的卵母细胞,采用体外成熟和体外受精的方法,研究不同浓度的铁(0.45mg/L,0.81mg/L,1.96mg/L,2.78mg/L)对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。结果如下:当卵母细胞在体外培养22h时,不同浓度的铁之间对卵母细胞体外成熟影响较小,差异不显著(p>0.05),且与对照组之间差异不显著(p>0.05);在体外受精的研究中,铁浓度为1.96mg/L和2.78mg/L的受精卵培养液可以明显提高8细胞胚胎发育率,差异显著(p<0.05);铁浓度为1.96mg/L的受精卵培养液可以明显提高囊胚发育率,囊胚发育率为31.6%,与其他浓度的铁相比,差异显著(p<0.05)。本试验结果说明:在卵母细胞体外成熟阶段,培养液中的铁对卵母细胞体外成熟没有影响,但对受精后早期胚胎的发育有促进作用,1.96mg/L是比较合适的早期胚胎培养液中铁的添加量。     

树鼩卵母细胞的体外成熟培养及体外受精

利用树鼩卵母细胞的成熟培养、体外受精等方法,生产树鼩的试管婴儿,期望通过此路径来实现生产转基因树鼩动物模型。使用促性腺激素进行树鼩超数排卵、TCM199完全培基对卵母细胞进行体外成熟培养、卵母细胞与体外获能的附睾精子进行体外受精、受精卵发育至桑椹胚、囊胚的实验。结果表明,卵母细胞成熟率A级76.7%、B级55.01%、C级17.39%。受精率52%,受精卵采用体细胞共培养与非共培养的分裂率分别为37.14%和9.6%。桑椹胚/囊胚发育率分别为13.57%和0,(P<0.05)。树鼩卵母细胞的成熟培养、体外受精实验方法可行,受精卵在体外能发育到囊胚阶段。     

幼龄小鼠卵泡的超数及卵母细胞同步成熟的研究

人工合成的雌性激素己烯雌酚可以促进出生18～20日龄左右的小鼠大量卵泡同步发育（有腔卵泡）,每只小鼠可获得300枚左右的未成熟卵母细胞,并在体外成熟培养16 h后,90%以上的卵母细胞排放第一极体,体外受精后2细胞的分裂率达到50%～65%,受精卵经体内培养后,发育到囊胚的比例达到50%以上.以上结果表明,幼龄小鼠卵巢卵母细胞能在外源的雌性激素作用下大量同步发育,并能在体外成熟、受精与发育至囊胚期胚胎.该研究结果不仅为深入探讨哺乳动物卵母细胞发育及成熟机制奠定基础,更重要的是为大家畜提供了一个重要的卵母细胞的来源途径.     

提高牛体外性控胚胎效率关键技术研究

为了提高牛体外受精效果,试验从性控冷冻精液体外获能方法及抗氧化剂的添加、体外成熟24h后卵母细胞是否部分脱除卵丘细胞3个方面,研究了影响牛性控精液体外受精效率的关键技术。结果表明,一次离心体外获能法体外受精卵裂率[(68.3±3.7)%]、囊胚率[(30.9±2.3)%]与精子上浮获能法体外受精卵裂率[(67.8±2.6)%]、囊胚率[(29.7±3.7)%]无显著差异(P>0.05),但显著高于二次离心体外获能法体外受精卵裂率[(56.1±4.1)%]、囊胚率[(21.6±4.6)%](P<0.05);获能液和体外受精液添加1.0%抗坏血酸组体外受精卵裂率[(70.2±3.2)%]、囊胚率[(35.0±4.7)%]显著高于不添加组体外受精卵裂率[(60.0±4.5)%]、囊胚率[(28.3±3.6)%](P<0.05);在体外受精前,成熟卵母细胞周围的卵丘细胞脱除情况为部分脱除组体外受精卵裂率[(70.1±4.6)%]、囊胚率[(35.5±3.7)%]显著高于不脱除组体外受精卵裂率[(52.9±4.1)%]、囊胚率[(26.1±3.6)%](P<0.05)。由此可见,性控精液体外受精时,获能方法宜采用一次离心体外获能法或上浮获能法,且精子获能液和体外受精液中宜添加抗坏血酸;体外受精前,成熟卵母细胞部分脱除卵丘细胞对于提高性控精液体外受精胚胎发育率具有重要意义。     

共培养系统的体细胞类型和状态对猪胚胎早期发育的影响

经体外成熟、受精和培养获得猪胚胎 ,采用体细胞共培养研究了体细胞类型和状态对胚胎早期发育的影响。取体外成熟的不同直径卵泡 (>5 m m,2～ 5 mm)卵母细胞的卵丘团 (颗粒细胞团 ) ,培养铺层后与猪受精卵共培养 ,组间受精卵的卵裂率和发育能力无显著差异 ;根据卵巢的状况对猪输卵管上皮细胞 (POECs)的状态进行分组 ,受精卵和卵巢表面布满卵泡的 POECs共培养 ,卵裂率显著低于卵巢表面有黄体和 /或红体的 POECs共培养组 (P<0 .0 5 ) ,虽然各组间 3～ 4-细胞的发育率无显著差异 ,但卵巢表面有红体和卵泡的 POECs共培养组的 >4-细胞的发育率显著高于卵巢表面布满卵泡的 POECs共培养组 (P<0 .0 5 ) ;受精卵在共培养系统和非共培养系统中的卵裂率无显著差异 ,受精卵非共培养系统中 3～ 4-细胞的发育能力显著低于颗粒细胞共培养组 (P<0 .0 5 ) ,极显著低于 POECs共培养组 (P<0 .0 1) ,无能力突破 4-细胞继续发育 ,与颗粒细胞单层、POECs单层共培养的受精卵 >4-细胞的发育率分别为 2 4.0 %、5 3.8% ,差异显著 (P<0 .0 5 )。结果表明 ,共培养系统对胚胎体外发育的作用 ,一方面与体细胞类型有关 ,另一方面也受输卵管上皮细胞状态的影响     

体外培养条件对延边黄牛受精卵体外发育的影响

从延边黄牛卵巢中采集未成熟的卵母细胞进行体外成熟培养、体外受精及受精卵体外培养。结果表明 :1将卵子用 2种不同的培养液进行体外成熟培养和受精卵体外培养 ,TCM199组的卵裂率 (5 6 .3% )极显著高于 D- PBS组(33.6 % ) (P<0 .0 1) ;TCM199组的囊胚发育率和孵化率 (15 .1%、13.7% )虽高于 D- PBS组 (10 .5 %、8.7% ) ,但 2个组之间无显著差异 (P>0 .0 5 )。2以 TCM199作为基础培养液 ,分别用含激素培养液和不含激素培养液进行成熟培养和受精卵体外培养 ,添加激素组的卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率 (81.2 %、17.5 %、15 .3% )高于没有添加激素的对照组 (75 .8%、12 .1%、10 .5 % ) ,但 2个组之间无显著差异 (P>0 .0 5 )。 3体外受精卵与单层颗粒细胞共培养组的卵裂率、囊胚发育率及囊胚孵化率 (78.0 %、11.5 %、9.9% )显著高于非共培养组 (6 8.1%、5 .4 %、3.6 % ) (P<0 .0 5 )。     

血清对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎发育的影响

从屠宰场收集了本地水牛55头、黑白花奶牛22头的卵巢共获卵泡847枚,平均每个水牛卵巢回收3.67枚可用卵母细胞,约为黑白花奶牛(10.23枚/头)的1/3。试验分别采用添加与不添加血清的培养液体外成熟培养水牛卵母细胞,结果二者的成熟率无明显毒性差异(58.23%对56.67%),但体外受精后早期胚胎发育的8-细胞率有显著差异(35.4%对23.0%),表明体外成熟液中有无血清对水牛卵母细胞体外成熟率没有影响,但血清对卵母细胞的早期胚胎发育有重要影响。进一步比较成熟液中不添加血清但在受精液及胚胎液中添加血清和在各个阶段均有血清参与的早期胚胎发育率(8-细胞率),表明二者差异不显著(33.8%对35.4%)。经无血清成熟培养液培养的成熟卵母细胞可以经孤雌激活后得到早期胚胎(4细胞)。     

发情牛血清对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

在动物卵母细胞体外成熟及胚胎体外培养体系中添加一定浓度的发情牛血清可能提高卵母细胞的成熟率及胚胎的发育率。本研究以屠宰场卵巢来源的绵羊卵母细胞为试验材料,探讨了发情牛血清对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响。结果表明,成熟液中添加10%第1天的发情牛血清能显著提高绵羊卵母细胞的体外成熟率及孤雌胚卵裂率(P＜0.05);孤雌胚体外培养72 h后,向培养液中添加10% 第7天的发情牛血清能显著提高绵羊孤雌胚的桑囊胚率(P＜0.05)。结果表明,发情牛血清能够促进绵羊卵母细胞的体外成熟率及孤雌胚发育率。     

不同繁殖季节驴卵母细胞体外成熟与孤雌激活胚胎发育情况研究

为了研究驴在繁殖与非繁殖季节卵母细胞体外成熟与孤雌激活胚胎发育情况,试验以3—9月份为繁殖季节,其他月份为难繁殖季节,从屠宰场采集驴卵巢,统计分析不同繁殖季节卵巢形状的差异,采用抽吸法和切割法获取卵母细胞,并对卵母细胞进行体外成熟诱导,对成熟的卵母细胞进行孤雌激活,分析激活胚胎的发育情况。结果表明:繁殖季节与非繁殖季节卵巢形状差异明显。在繁殖季节,卵巢内卵泡液增多且卵泡体积变大,导致卵巢体积增大,总卵泡、中卵泡、小卵泡数量显著多于非繁殖季节(P0.05);繁殖季节卵母细胞回收率为85.38%,非繁殖季节卵母细胞回收率为72.18%,两者差异显著(P0.05);繁殖季节驴卵母细胞体外培养成熟率为50.10%,非繁殖季节时成熟率为34.74%,两者差异显著(P0.05);繁殖季节卵裂率为31.0%,非繁殖季节卵裂率为29.0%,两者无显著差异(P0.05)。说明繁殖季节卵母细胞体外成熟情况优于非繁殖季节,非繁殖季节较难获得成熟卵母细胞,但是获得成熟卵母细胞激活发育后无明显差异。     

卵泡直径对辽宁绒山羊卵母细胞体外培养的影响

本试验以屠宰场绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集不同直径卵泡卵母细胞,研究卵泡直径对卵母细胞回收效果和体外成熟、体外受精的影响。结果表明,卵泡直径直接影响卵母细胞的回收效果及随后的体外成熟、体外受精;卵母细胞的回收率和可用卵的比率及成熟率与卵泡直径呈正相关;直径2.1～5 mm卵泡的卵母细胞由于处于生长旺盛期,受精率和卵裂率分别为59.15%和42.50%,显著高于直径5 mm卵泡和≤2 mm卵泡,适合体外胚胎的生产,而直径≤2 mm卵泡的卵母细胞因未发育充分体外发育潜能最差;直径5 mm卵泡的卵母细胞可能因体外培养成熟过度而老化导致受精率和卵裂率降低,缩短其体外成熟时间可能会提高其体外发育潜能。     

绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养的研究

在体外受精过程中,绵羊卵巢卵母细胞体外成熟情况在很大程度上决定着卵母细胞的体外受精率和胚胎发育率.影响卵母细胞成熟的因素很多,主要包括卵泡大小、卵巢的发育阶段、培养基、激素生长因子等.试验从屠宰场采集屠宰后的绵羊卵巢,抽取卵巢表面卵泡中的卵母细胞,选择一级和二级卵母细胞进行体外成熟培养.试验证明,绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养时间以24h为佳,FCS浓度以20%最适宜.试验还发现无菌条件、温度、湿度以及在体外对卵母细胞的操作时间对试验的结果都有很大的影响.通过试验初步探明了适宜绵羊卵母细胞体外成熟的一些基本条件,为全面掌握绵羊卵母细胞体外成熟培养以至整个体外受精技术的完善和规范提供了有益的资料.     

猪卵巢卵母细胞的体外成熟和体外受精

将从屠宰母猪卵巢采得的卵母细胞-卵丘细胞复合体(Oocyte-cumulus Cell Complex.OCC)在含PMSG的M199培养40～44小时,卵丘细胞大部分扩散(86.4％)。48.1％(142/295)的卵母细胞排出第一极体(PBI)。将体外成熟的卵母细胞与体外获能精子授精后30～70小时,80.5％(103/128)的卵母细胞受精并可在体外发育到2～8细胞甚至桑椹胚。本文还对裸卵母细胞的体外成熟和体外受精进行了研究,对体外受精卵的早期发育作了观察。实验结果表明:PMSG对诱导卵丘细胞扩散及卵母细胞的全面成熟有重要作用,在OCC中的卵母细胞成熟率高于裸卵母细胞体外授精后8～10小时将受精卵放入改良KRB液培养可使卵裂比例明显提高。     

卵泡数量对陕北白绒山羊卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响

为了进一步探索陕北白绒山羊卵母细胞体外成熟的方法,试验以屠宰场陕北绒山羊卵巢为材料,采用抽吸法收集直径大于2 mm卵泡的卵母细胞,研究卵泡数量对卵母细胞体外成熟和孤雌发育的影响。根据卵泡数目的差异分为3组,其中卵泡数目大于15个的设为Ⅰ组,卵泡数目在8~14个之间的和卵泡数目在1~7个之间的分别设为Ⅱ组和Ⅲ组。对山羊卵母细胞及孤雌激活后胚胎进行体外培养后,进而根据山羊卵母细胞体外成熟率、孤雌激活胚卵裂率和囊胚发育率来分析卵泡数量对其发育的影响。结果显示卵泡数目在8~14个之间的Ⅱ组山羊卵母细胞体外成熟率显著高于其他两组(P0.05),而这3组间的卵裂率和囊胚率差异不显著(P0.05)。表明山羊卵泡数目的过多或过少降低了卵母细胞体外成熟效率,且对孤雌激活胚的发育能力无影响。     

不同屠宰方式山羊卵巢卵母细胞的体外成熟比较

从屠宰场采集的卵巢567枚，用抽吸法获COCs2851枚，其中适宜体外成熟培养的A、B级COCs1129枚，获可用COCs2．0枚／卵巢；繁殖季节的卵巢平均回收COCs数、COCs可用率和平均可用卵数分别为5．8枚、49．2％、2．9枚，均较非繁殖季节高（分别为4．7、34．5％、1．6），山羊发情较为集中的秋季卵巢卵母细胞的回收数和可用数均较其他季节高。对2种来源的屠宰场卵母细胞进行体外成熟培养，结果显示来源于“烫毛＋烤皮”屠宰方式的卵母细胞体外成熟率为84．5％；来源于“屠宰＋烫毛”，不经过烤皮处理的屠宰场卵母细胞体外成熟率为90．4％，二者无显著性差异（P〉0．05），说明屠宰时经高温处理羊只的卵巢卵母细胞也能在体外培养中继续发育成熟；试验采用的成熟液和培养体系较适合山羊卵母细胞的体外成熟。     

表皮生长因子、巯基乙醇和亚硫磺酸对山羊体外胚胎生产的影响研究

采用抽吸法收集卵巢上的卵丘 -卵母细胞复合体 (COCs) ,微滴培养法于不同成熟培养液 (n =8)中培养 2 4～ 2 7小时后体外受精 ,然后移入不同胚胎培养液 (n =7)中培养 7天。应用胞核染色、胚胎移植等技术判定并统计成熟率、卵裂率和胚胎发育潜能。结果 :含 5 0ng/mlEGF(表皮生长因子 )组COCs成熟率 (75 4 5 %～ 75 8%)和卵裂率 (72 4 %～ 74.1%)均显著高于其它组 ,含 0 5mmol/LHTAU(亚硫磺酸 )组和或 10 0 μmol/LCYS(β -巯基乙醇 )成熟液组的≥ 8细胞率 (3 2 3 %～ 3 9 0 %)和桑胚率 (2 8 4 %～ 3 3 .8%)均显著高于其它组 (P <0 0 5 )。两只试管羊健康出生。结论 :EGF对COCs体外成熟和卵裂发育具有明显的促进作用 ;CYS对COCs体外成熟和受精卵裂无明显正作用 ,但成熟液含适量CYS有助于改善胚胎的体外发育 ,过量可能对细胞有毒 ;HTAU有益于早期胚胎的体外发育。成熟液中EGF和CYS的优选浓度分别为 5 0ng/ml和 10 0 μmol/L ;胚胎培养液中HTAU的优选浓度为 0 5mmol/L。优化体系所得胚胎具有正常的发育潜能。     

奶牛活体采卵与屠宰场卵巢卵子体外生产胚胎的效果比较

先利用屠宰场卵巢获得的卵母细胞进行体外培养试验.在建立了培养体系获得较稳定的囊胚率的基础上,再利用具有优良乳用遗传性状的老龄奶牛进行活体采卵(OPU),获得的卵子进行体外胚胎生产,对奶牛活体采卵与屠宰场卵巢卵子体外生产胚胎的效果进行了比较.同时对奶牛重复OPU的效果及OPU卵子的培养天数对妊娠率的影响因素等进行探讨,试图为研究和生产建立一个高效的活体采卵体外胚胎生产方法.结果表明:(1)活体采卵获得的卵母细胞从形态以及后期的发育情况均明显差于屠宰场卵巢获得的卵子;OPU法的卵裂率、囊胚率(70.5%、18.3%)明显低于从屠宰场卵巢获得的卵子的卵裂率、囊胚率(75.1%、34.8%)(P＜0.01).(2)不同个体采集卵子数量差异明显(5.92枚/头与1.4枚/头)(P＜0.05).(3)同一头奶牛每次采卵数之间无显著差异,但有波动性变化.(4)奶牛OPU卵子经培养在第6 d或第7 d发育至囊胚的胚胎移植妊娠率高于第8 d发育至囊胚的胚胎.