猪瘟病毒石门重组标记毒株的构建与拯救

【目的】中国控制猪瘟主要采用疫苗免疫,现有的猪瘟兔化弱毒疫苗有较好的免疫保护效果,但是不能从血清学上区分疫苗免疫猪与自然感染猪,猪瘟标记疫苗的研制与配套检测技术的开发可有效解决这一问题。【方法】利用猪瘟病毒低温诱变弱毒T株感染性克隆,将其全长结构蛋白基因替换为猪瘟病毒石门毒株全长结构蛋白基因,得到猪瘟石门重组病毒的全长感染性克隆pSMT;随后在pSMT E1蛋白的C端插入Flag抗原基因作为鉴别标记,构建猪瘟石门重组标记病毒的感染性克隆pSMT-Flag。经电转染法拯救出两株重组病毒vSMT和vSMT-Flag,通过SK6细胞进行病毒传代以获得重组病毒。【结果】多组酶切鉴定表明两株重组质粒成功构建,PCR扩增及测序、免疫过氧化酶单层细胞试验（IPMA）表明重组病毒已成功拯救且能成功传代。【结论】该标记病毒能够与Flag单抗发生特异性反应,且不影响E2蛋白中和表位与猪瘟单抗的结合,因此该毒株为研制CSFV新型标记疫苗提供了思路。     

稳定表达猪miRNA let-7c细胞株的建立及其对CSFV的调控作用

【目的】构建含有let-7c前体基因的重组质粒pGene-pre-let-7c,建立稳定表达猪miRNAlet-7c细胞株,研究let-7c对猪瘟病毒(CSFV)复制的调控作用。【方法】利用RNA22软件筛选出CSFV基因组3′-UTR潜在的let-7c结合位点,PCR扩增出let-7c前体片段,连接到表达载体pGenesil-1.1-dBm2上,构建重组质粒pGene-pre-let-7c,采用脂质体法将重组质粒转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),经G418抗性压力筛选获得阳性细胞株。对获得的阳性细胞株进行接毒试验,检测CSFV的复制情况。用MTT比色法检测阳性细胞的增殖情况。【结果】成功扩增出let-7c前体基因,并构建了pGene-pre-let-7c重组质粒。重组质粒转染SUVEC细胞后筛选获得了稳定表达let-7c的细胞株。let-7c可下调CSFV在细胞中的复制。【结论】let-7c可下调CSFV的RNA复制水平。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

陕西省猪瘟病毒流行毒株E2基因变异分析初报

根据GenBank公布的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)Shimen株全基因序列,设计并合成2对引物,用RT-PCR方法对采自陕西省部分地区的30份CSF病料中,CSFV流行毒株的E2基因进行了扩增,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌DH5α。提取pMD-18T-E2重组质粒,进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与HCLV疫苗株和shimen株E2基因及E2蛋白进行序列分析。结果表明,从30份病料中共扩增到10株CSFV流行毒株的E2基因;扩增的10株陕西CSFV流行毒株E2基因同源性为92.3%~99.6%,与Shimen株及HCLV疫苗株的同源性为75.0%~79.4%;10株CSFV流行株E2蛋白的同源性为90.0%~100%,与Shimen株和HCLV疫苗株E2蛋白的同源性分别为78.9%~84.4%和77.8%~83.3%。说明所扩增的10株陕西CSFV流行毒株的E2基因发生了较大变异。     

猪瘟流行毒株E2基因主要抗原区的原核高效表达

【目的】构建猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)E2基因主要抗原区原核表达质粒载体,高效表达E2蛋白,为进一步研究E2亚单位疫苗提供物质基础。【方法】用RT-nested PCR技术扩增CSFV流行毒株SX-YL株E2基因主要抗原区,克隆于表达载体pET32a中,成功构建表达质粒pET32a-E2,将pET32a-E2转入BL21(DE3)受体菌并用IPTG诱导表达E2蛋白,对E2蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析和可溶性鉴定。【结果】CSFVE2基因得到了高效表达,表达蛋白量占菌体蛋白量的33.2%,表达蛋白E2主要以包涵体形式存在;免疫印迹分析结果表明,表达蛋白E2能识别天然猪瘟多克隆抗体。【结论】E2蛋白表达量高并具有生物学活性。     

猪瘟病毒石门株动物传代脾毒与组织培养细胞毒E2基因序列的分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。     

猪瘟病毒C株E2基因克隆及重组pGAPZα的构建

从猪瘟弱毒活疫苗中提取猪瘟病毒(CSFV)RNA,采用RT-PCR技术,得到E2基因的cDNA,连接到pMD-18T载体上进行测序。将E2基因的cDNA及质粒pGAPZαA分别以内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行顺序酶切,连接酶切产物并转化Escherichia coliDH5α。经过抗生素Zeocin筛选、PCR鉴定和重组质粒的酶切分析,将E2基因的测定序列与GenBank中的CSFV C株E2基因序列(序列号Z46258)比对,核苷酸同源性为99.46%;获得6个阳性重组子的克隆株。结果表明,重组质粒pGAPZα-E2中目的基因E2的核苷酸序列和大小、插入方向和位置是正确的。     

猪瘟病毒RT-nPCR检测方法的建立及陕西部分地区猪瘟病毒E0基因分子特征分析

【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒(CSFV)RT-nPCR检测方法,为临床诊断提供一种可靠方法,同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析,揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征,为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列,设计并合成了2对引物,建立猪瘟RT-nPCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测,并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L,从BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV等参考毒株中提取或反转录获得的DNA/cDNA中不能扩增出目的条带,提示方法灵敏度高、特异性强。对32份疑似猪瘟组织病料的检测发现,有12份呈现阳性,阳性率为37.5%。序列分析表明,8株流行毒株间E0核苷酸、氨基酸同源性分别在97.0%~99.3%和94.8%~98.5%。与参考毒株的核苷酸同源性为83.4%~95.4%,氨基酸同源性为85.8%~98.1%。流行毒株与我国疫苗毒株HCLV、C HVRI的核苷酸同源性仅为83.4%~85.1%,氨基酸同源性仅为86.1%~89.1%,呈现出较明显的远离疫苗株的变异趋势。进化树分析发现,8个流行毒株均属于基因Ⅱ群。首次发现了1株流行毒株(SXWN02株)E0Rnase活性基序位点第94位由E变异为K,其他位点未发生变异。【结论】建立的RT-nPCR检测方法灵敏度高、特异性强,可作为猪瘟病毒的临床诊断方法。陕西部分地区猪场猪瘟感染仍较严重,需要做好防控工作。流行毒株E0基因发生较大变异,尤其是在关键位点上出现变异毒株,需要密切关注。     

猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒（482代）、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。     

福建省猪瘟病毒流行毒株E0基因的克隆与序列分析

【目的】对我国福建省流行的猪瘟病毒E0基因进行序列测定及分析。【方法】应用RT-PCR,从我国福建省送检的54份病料中扩增出14份猪瘟病毒E0基因,将其克隆到T载体上并测序。利用DNAstar分析软件,对所测定的14株流行毒株与参考毒株的相应基因片段进行同源性及序列分析。【结果】得到约801 bp的猪瘟病毒E0基因片段。序列分析表明,14株福建流行毒株可分为2个基因群,其中FJ216与ALD、Alfort187、Brescia、C HVRI、GPE、Glentorf、CAP、Shimen和HCLV等我国主要参考毒株属于基因1群,其他13株流行毒株和我国另一分离株GXWZ02属于基因2群。基因1群的FJ216与HCLV的核苷酸和氨基酸同源性分别为95.0%和94.3%,与Shimen的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4%和99.1%;而另外13株流行毒株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89.7%~99.9%和93.84%~99.6%,13株流行毒株与HCLV株的核苷酸和氨基酸同源性分别为81.8%~88.1%和86.8%~89.5%,与Shimen株的核苷酸和氨基酸同源性分别为83.4%~90.8%和88.6%~93.9%。得到的14株猪瘟病毒E0基因具有RNase活性的2个区域均高度保守,没有发生变异。【结论】福建省近期流行的猪瘟病毒以基因2群为优势毒株,而且大多数与HCLV、Shimen毒株之间存在较大差异。     

利用工厂化养猪理论参数动态监测猪群生产

猪群生产是猪场日常工作的核心，一个猪场的效益主要由猪群生产的水平高低而直接体现。而猪群生产中的基础母猪数量、每周配种母猪数、怀孕率、分娩率、窝均产仔数、仔猪存活率、育仔存活率、育成存活率、母猪淘汰率和母猪分娩指数等工厂化养猪参数又是直接衡量猪群生产的水平高低的一系列硬指标，因此，利用工厂化养猪参数可以监测某个时间段的猪群生产的状态。原理是依据现有猪场的基础母猪数量和猪群的某个时间段初期的实际繁殖状态，通过计算机根据工厂化养猪理论参数模拟运算产生出标准猪群生产数据，将之与猪场猪群生产的实际数据相比较，并制出曲线对比图，从对比图中可直观看出猪群生产中的各个环节的优劣，这样就实现了对猪群生产的某个时间段的动态监测功能。     

集约化养猪场粪污处理工艺设计探讨

依据生态经济学和循环经济学原理,将厌氧生物技术、接触氧化技术以及综合利用技术进行组合来治理养殖场污水。结合福州市闽侯荆溪福建省农科院种猪场污水治理工程实践,表明该技术可以解决禽畜养殖业的废水污染问题,处理后水质:CODCr为58 mg.L-1、BOD5为13.3 mg.L-1、SS为72 mg.L-1、NH3-N为34.9 mg.L-1,TP为7.2 mg.L-1,均符合国家《畜禽养殖业污染物排放标准》规定的要求,而且工程运行效果稳定,经济效益和生态效益显著。     

免疫猪群暴发猪瘟的诊断与分析

对某种猪场猪瘟免疫猪中暴发的一种高热、高死亡率传染病进行流行病学调查、病理变化观察和免疫荧光抗体检查,确诊该种猪场所暴发的传染病为猪瘟。此外,用间接血凝试验对21日龄超前免疫仔猪的血清中猪瘟抗体水平进行了检测,结果表明,仔猪的免疫合格率为78 9%。     

猪骨调素OPN基因多态性的研究

根据GenBank公布的猪OPN基因,设计3对引物,采用微卫星标记技术和PCR-SSCP技术检测猪OPN基因的多态性.结果显示,引物P1位点上检测到5个等位基因和4种基因型,引物P2和P3上分别存在2个等位基因和2个基因型.遗传多态性分析结果表明,P1位点上,小梅山猪的纯合度最高,为0.518,大白猪纯合度最低,为0.290.P2和P3位点上两个品种纯合度差异不大;大白猪的群体平均杂合度大于小梅山猪,其杂合度分别为0.481、0.388.     

氯前列烯醇在中小规模猪场的应用

我们在下乡培训,入户入场诊疗过程中,发现有70％以上的养殖户累于夜间看护母猪产仔,母猪产后子宫炎、阴道炎以及治疗母猪迟产时方法少而苦恼,我们对这些症群、症候制定了预防和治疗相结合的方针,治疗上主要应用氯前列烯醇,取得了满意的效果,现整理出来,以便更多的养猪户从中受益。     

合作猪肉质常规性状分析

对合作猪肉品理化特性、食用营养特性等肉质常规性状进行了测定与分析,结果表明:合作猪肉色鲜红,45 min内肉色值评分为3.44;肌肉大理石纹适中,系水力强;失水率和滴水损失均值分别为:11.05%、1.33%;剪切力值小,具有良好的肌肉理化特性.合作猪食用营养价值较高,脂肪含量、蛋白质含量测定均值分别为2.11%、21.09%;并富含多种人体必需的矿物质元素及微量元素,具有较高的研究与开发价值.     

猪丹毒病的防治体会

2010年5～6月份,我们诊治了多起猪丹毒病,此病已十余年在豫北地区未发现,这次先是在辉县市拍石头乡横岭村,后在上八里镇、胡桥乡、高庄乡、孟庄镇多个养猪场出现病例.我们通过诊断、制定防制方案、消毒等措施取得了令人满意的效果,减少猪的死亡,为增加养殖场的经济效益奠定了基础.     

猪链球菌的分离与鉴定

从发病猪场死亡仔猪的肝、脾和淋巴结病料中分离到一株细菌，经细菌形态学观察、鉴别培养和生化分析，鉴定为链球菌。该菌株对小白鼠存在致病性。药敏试验表明，该菌株对氨苄青霉素、阿莫西林和先锋V高度敏感，对青霉素、磺胺类药、蒽诺沙星、环丙沙星低敏。     

猪日粮对比试验的分析方法研究

在猪日粮对比试验资料中,常常包括试验初始重等影响试验结果但不是试验结果的因素。统计分析时必须考虑这类连续性变量,以降低残差方差,提高检验功效。这类资料常用的分析方法为协方差分析法。首先介绍了协方差分析的统计学假设及其检验方法,然后给出了协方差分析法。本文的所有分析方法都利用SAS实现,详细介绍了如何阅读SAS程序结果。     

新型生猪标识及肉产品可追溯系统的设计和实现

本文介绍一种新型生猪标识的研制,在利用新型生猪标识的基础上,采用信息网络技术、数据库技术、构件化软件设计技术、条形码和电子标识技术,进行生猪可追溯系统的设计,并在生猪养殖场、屠宰场、超市实现并成功示范。同时也介绍了国内外生猪标识的研究以及发达国家可追溯系统的试点及实施情况,为我国生猪和猪内产品可追溯系统建设提供参考,最终实现生猪的安全生产和肉产品的安全消费。