表达序列标签(ESTs)及其应用

表达序列标签(ESTs)是指从(ESTcDNA文库中随机挑取克隆并对其3'或5'端进行单轮自动测序所获得的短cDNA库列,一般长度为300～500bp.要有效获取ESTs,必须对cDNA文库进行预处理,处理方法有衰减杂交法、均一化法和差异显示法.在dbEST中收录了大量各种生物的ESTs.ESTs广泛应用于鉴定基因、发现新基因、电子克隆、构建遗传学图谱、制备DNA芯片、分子标记、研究基因的差异表达及检验病原微生物等方面.     

表达序列标签(ESTs)及其数据库

表达序列标签(EST)是在生物体中表达基因的一段cDNA序列，它已成为基因定位、基因克隆、基因表达序列分析的有力工具。本文主要介绍了EST的制备方法，EST数据库，同时分析了EST在应用中应解决的问题，并展望了其应用前景。     

鸡下丘脑组织表达序列标签初步分析

为了鉴定所构建的鸡下丘脑组织 c DNA文库能否用于下丘脑表达谱的建立 ,从 c DNA文库中随机挑取 12个克隆 ,对其表达序列标签 (expressed sequence tags,ESTs)进行了测定和初步分析。经 BL ASTn和 FASTA3.1分析后发现 ,1个 ESTs在 Gen Bank中可以找到鸡的同源序列 ,4个在其他物种中也可以找到同源序列 ,1个在 ESTs database中有同源 ESTs序列 ,还有 6个为未知功能基因。 12个 ESTs序列均已录入 Gen Bank。     

黄鳝肠道cDNA文库构建及营养相关表达序列标签分析

本研究旨在构建黄鳝肠道未剪切cDNA文库,对黄鳝肠道营养相关基因表达进行初步分析.以黄鳝全肠为试验材料,采用Invitrogen公司的Gateway技术构建了黄鳝肠道未剪切cDNA文库,并进行规模表达序列标签(expressed sequence tag,EST)测序和分析.结果表明:文库的库容量为1.46×107CFU,重组率达96.88%,平均插入片段长度2.11kb.随机挑取1056个cDNA阳性克隆进行测序,共获得906条有效的EST,其中886条的长度大于400bp,拼接组装得到762个单基因簇(unigene),包括61个重叠群(contig),701个单拷贝EST(singleton);与营养相关的EST共有5类59种,其中:蛋白质/氨基酸代谢类25种,碳水化合物代谢类13种,脂类代谢类5种,能量代谢类12种,无机离子代谢类4种.本文成功构建了黄鳝肠道未剪切cDNA文库,并进行了EST序列测定和分析,筛选出营养相关EST,为后续研究提供了基础数据.     

表达序列标签在寄生虫基因研究中的应用

一个基因组的所有碱基中大约只有2％组成编码蛋白质的那部分基因，因此，测序基因组已不再是一种创建基因目录的有效途径。大量的试验证明，以cDNA的形式进行基因转录产物的大规模测序是了解基因组的首选办法。高通量cDNA测序于1991年由Adams等创始，在构建人脑的cDNA     

大片吸虫成虫FG0018表达序列标签序列的电子克隆分析及实验验证

用大片吸虫成虫FG0018表达序列标签(Expressed Sequence Tags,ESTs)序列对NCBI数据库进行Blastn比较,采用生物信息学方法,运用网上数据库资源,结合相关生物信息学软件将目标序列进行搜索、处理、拼接、延伸,得到的最后重叠群(contig,命名为FG0018C0N)与肝片吸虫卵壳蛋白B2序列(GenBank:M93025)相似性很高,用DNASTAR、SEQMAN程序和Blast2程序分析FG0018CON,推测其开放阅读框为930bp,编码310个氨基酸,蛋白质的特点及跨膜区预测其编码蛋白可能属于核蛋白,疏水性分析表明其编码一疏水蛋白.FG0018CON基因与肝片吸虫卵壳蛋白基因有100%的相似性,310个氨基酸与之有91%的一致性.经RT-PCR、酶切验证并cDNA测序,结果证明FG0018C0N序列可能是大片吸虫的卵壳蛋白基因.     

λgtl0 cDNA文库表达序列标签测定时模板处理方式

表达序列标签是揭示基因组容量的有效方法。在构建cDNA文库的基础上，对以λgtl0为载体进行表达序列标签到定时模板的处理方法进行了探讨。结果表明，以λ噬菌体DNA为模板直接测序比PCR产物经回收后为模板进行测序，其目标克隆的平均插入片段长度要长，但反应成功率低。以λ噬菌体浸提液为模板进行PCR并在产物回收后进行测序反应，可能是以λ噬菌体为载体构建文库的表达序列标签测定的最佳选择。     

应用mRNA差异显示技术筛选绵羊皮肤毛囊差异表达序列标签

为寻找与绵羊羊毛生长相关的基因,应用mRNA差异显示技术(DD-PCR)筛选拔毛皮肤与正常皮肤表达水平有差异的cDNA,用Northern blot证实差异显示基因片段,对差异基因进行测序和同源比较。经差异显示分析,共找到差异表达的序列片段21个;经2次扩增、克隆、Northern Blot分析,最终确定2个差异条带SQ70和SQ75。对这两个差异条带进行测序及生物信息学分析,发现SQ70是绵羊皮肤中与组织修复相关的EST片段,而SQ75是绵羊皮肤或者是毛囊中高表达的未知EST片段。以上结果表明,SQ70和SQ75可能是与绵羊羊毛生长密切相关的基因表达产物,对于这两个ESTs具体的生物学功能有待于进一步研究。     

猪肌肉组织表达序列标签(ESTs)的分析

研究构建了民猪肌肉组织cDNA文库,并在文库中随机挑选克隆进行测序,获得107个高质量的ESTs。经生物信息学分析,所研究的107个ESTs中,有98个单一克隆,其中71个为人类及其他物种的同源序列,23个为猪的已知ESTs,4个为未知ESTs。对这4个未知ESTs进行开放阅读框预测并进行BLASTn分析,没有找到高度同源的氨基酸序列。对已知功能基因表达谱的构建和分析结果表明:最多的是未分类,占47.88%;然后依次是基因/蛋白表达占26.76%、细胞代谢占9.86%、细胞结构/迁移占8.45%、细胞/机体防御占4.23%和细胞信号/传导占2.82%。     

家蚕幼虫性腺表达序列标签分析（英文）

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库。利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得16 737条ESTs（精巢8 407条,卵巢8 330条）,拼接这些ESTs共得到2 107个重叠群（con-tig）和3 532个单拷贝（singlet）。将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性。功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在。基因本体（gene ontology）功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大。研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息。     

犬弓首蛔虫雄虫cDNA文库构建及EST分析

为构建T.canis雄虫cDNA文库,采用Trizol法提取T.canis雄虫的总RNA,合成cDNA,连接到λTripEx2载体上,通过包装蛋白对连接产物的包装,接种到大肠杆菌XL-1-Blue中进行原始文库和扩增文库的滴度测定.经质量鉴定表明:初始文库的滴度为5.25×106 pfu·mL-1,扩增后文库的滴度为6.90×109 pfu ·mL-1.文库的插入片段大小在500～2 000 bp,平均片段大小为1 000 bp,重组率为99.47％.所有指标均显示已成功构建了T.canis雄虫的cDNA文库.利用该文库获得了189条5'有效表达序列标签(EST).对ESTs拼接后代表了101个Unigenes,含有27个Contigs和74个Singletons.其Unigenes在GenBank中的序列号为HO348195～HO348295.同源性分析检索到有56个Unigenes与已知基因同源,其中具有已知或推测功能的基因有40个,未知功能基因有16个,未比对上的基因45个.未比对上的基因与NR数据库中的蛋白序列没有任何意义的匹配,为研究中发现的新基因.这些结果为进一步开展犬弓首蛔虫功能基因及分子机制研究奠定了基础.     

柞蚕蛹全长cDNA文库的构建和随机EST测序

采用RNA转录5′末端转换(SMART)技术构建了柞蚕(Antheraea pernyi)蛹的全长cDNA文库。所构建cDNA文库的容量为5×105个独立克隆,插入片段长800~2500 bp,且90%的插入片段大于1 kb。随机挑取288个克隆进行表达序列标签(EST)测序,有效序列为250条,根据EST测序结果计算文库重组率达95%。经序列拼接得到175个unigenes,通过序列比对发现其中97个unigenes与GenBank中的已知基因高度同源,且有88条全长序列,基因的完整性比率达90%。在随机EST测序中获得了具有5′端和3′端非编码区的延伸因子-1α基因(Gen-Bank登录号:FJ788508),该基因cDNA全长1743 bp,有一个1392 bp的开放阅读框,编码含463个氨基酸残基的蛋白,蛋白的理论分子质量为50.4 kD,等电点8.96。EST测序分析表明,柞蚕蛹cDNA文库符合构建基因文库的质量要求,该文库的构建将有助于柞蚕功能基因的克隆和研究。     

中华鳖表达序列标签资源中的微卫星信息分析

从NCBI下载中华鳖表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)序列178条及浙江省水产农业新品种选育重大科技专项课题组构建的中华鳖腐皮病肝脏cDNA文库测序得到的4 146条EST序列中,通过去除片段长度过短和冗余的序列,得到全长为1 630.26 kb的2644条无冗余EST。采用MISA软件从这些序列中搜索到197个SSR,分布于137条EST序列中,出现频率为7.45%,平均分布频率为8.28 kb。2和3碱基重复是中华鳖主要的重复类型,分别占EST-SSR总数的60.91%和35.53%。AC/GT和AGC/CTG是2、3碱基重复中的优势类型,分别占2、3碱基重复的44.17%和62.86%。结果显示,中华鳖EST数据库中SSR序列出现频率较高,类型较丰富,根据中华鳖EST数据发掘SSR标记是一条可行的途径。     

SSH与cDNA芯片技术的联合及其在植物基因差异表达研究中的应用

抑制消减杂交技术(SSH)与cDNA芯片技术是新近发展起来的研究差异表达基因的两种非常有效的方法。近年来,将SSH和cDNA芯片技术结合使用,为分析组织细胞的已知基因表达差异提供了新的手段,也为克隆和鉴定新基因开辟了新的道路,是目前寻找差异表达基因的适用方法。鉴于此,对SSH和cDNA芯片技术的基本原理、两种方法结合使用的操作流程、克隆差异表达新基因的特点,以及在植物基因差异表达方面的应用进行了概述。     

表达序列标签的应用现状及分析方法研究

表达序列标签是由大规模随机挑取的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。1个表达序列标签(EST)代表生物某一时期的某种组织或细胞的1个表达基因。数量迅速增加的表达序列标签已经成为开发分子标记的重要资源。介绍了EST原理、基因表达分析的方法比较、基因测序聚类分析的3个数据库比较及详细方法,表明EST在发现新基因及基因组研究中的应用具有良好的前景。     

家蚕EST数据库的应用现状及展望

家蚕是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的主要模式生物。表达序列标签(EST)在家蚕研究中的应用越来越受到关注。本文主要介绍了EST数据库的建立及其在家蚕研究中的应用现状,展望了EST在家蚕中的研究趋势。     

家蚕幼虫性腺表达序列标签分析(英文)

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库.利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得 16 737条ESTs(精巢 8 407条,卵巢 8 330条),拼接这些ESTs共得到 2 107个重叠群(contig)和 3 532个单拷贝(singlet).将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性.功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在.基因本体(gene ontology)功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大.研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息.