高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

2006年6月份以来,我国多个省份暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给我国养猪业造成了巨大经济损失.为全面了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在我国的流行情况以及遗传变异规律,本研究采用RT-PCR的方法,对从2006年8月至2007年10月期间,来自于19省(市)共474份样品进行高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的检测,结果检出阳性样品294份.在各省不同时期样品中均有阳性样品检出.通过对阳性样品进行Nsp2基因和ORF5基因扩增,序列分析发现所有检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒株高度同源,为同一毒株遗传变异而来,所有猪繁殖与呼吸综合征毒株与HB-1株遗传关系最近;且Nsp2均缺失30个氨基酸.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒双重液相基因芯片检测方法的建立

为了实现快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)并同步鉴别高致病性PRRSV毒株(HPPRRSV),根据PRRSV囊膜蛋白GP2基因保守序列和HP-PRRSV特有的Nsp2基因区保守序列设计特异扩增引物和杂交探针,通过双重一步法RT-PCR不对称扩增和双重微球杂交反应,建立了双重液相基因芯片方法。对12株PRRSV以及其他12种猪病原体的检测显示,该法能特异性检测12株PRRSV毒株并准确鉴别其中7株HP-PRRSV,与其他病原体无交叉反应;对PRRSV、HP-PRRSV病毒液的检测低限均小于每个反应0.5TCID_(50);其组内、组间检测变异系数均10%;检测55份疑似临床样品并与商品化荧光RTPCR试剂盒比较检测结果,符合率达98.2%(54/55)。研究结果为适应临床快速检测PRRSV提供了一种新的分子生物学检测方法。     

巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性评价

为评价巴马小型猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的敏感性,本研究选择PRRSV抗体阴性的16头巴马小型猪和17头本地二元杂交猪作为研究对象,分别分为低剂量接毒组、高剂量接毒组、对照组1和对照组2,低剂量、高剂量接毒组肌肉注射接种PRRSV NVDC-JXA1强毒株,对照组1和接毒组混合饲养,对照组2分开饲养作为空白对照。接毒后每天测量体温,观察精神、食欲、死亡等情况,死亡动物剖检病变,攻毒后每隔7d采血用RT-PCR法检测病原,连续观察21d。结果绝大部分猪体温升高到41℃以上,且有3个以上温次,所有接种及混养动物都死亡,巴马小型猪死亡时间在8d~17d,二元杂交猪在7d~13d,死亡动物出现肺充血、出血、实变,扁桃体、淋巴结、肝脏、肾脏、皮下有出血等症状,病原RTPCR检测为阳性,说明攻毒动物死于HP-PRRS,表明巴马小型猪对PRRSV NVDC-JXA1强毒株非常敏感,可用于PRRS活疫苗的检验。     

百色市高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测结果分析

为评估百色市猪群高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）免疫效果,2012年—2013年在66个规模养猪场和249个农村散养户分别采集猪血清样品465份和644份,使用间接 ELISA 检测 HP-PRRSV 抗体,结果显示,现2012年 HP-PRRSV 抗体平均阳性率为68．02％,2013年 HP-PRRSV 抗体平均阳性率为75．32％;HP-PRRSV 一免抗体平均阳性率为63．91％,二免抗体平均阳性率为83．60％;HP-PRRS 灭活苗免疫抗体平均阳性率为75．42％,HP-PRRS 弱毒苗免疫抗体平均阳性率为70．86％。说明2013年 HP-PRRSV 抗体平均阳性率高于2012年,二免的抗体平均阳性率高于一免;HP-PRRS 灭活疫苗的初步使用效果良好。     

表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的伪狂犬病病毒拯救与纯化

为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株,本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物,BamHⅠ引入到引物的5′端,从HP-PRRSV毒株的RNA中,用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接,构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE^-/gI^-/TK^-的ST细胞中,经病毒空斑纯化,获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞,经4轮病毒空斑纯化,最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序,证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基...     

1株临床高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

本研究从江苏省某猪场患有明显呼吸道临床症状和高热死亡的仔猪肺脏组织中分离到一株病毒,经病毒生物学特性测定、血清学试验、病毒基因鉴定,确定为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。人工猪体感染发病试验表明,该分离株可以引起商品仔猪出现明显临床症状和死亡,证实我国已经出现临床高致病性PRRSV毒株。     

应用生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原

应用激流式生物反应器培养Marc-145细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,并通过工艺优化,实现了病毒抗原的高效生产。首先将Marc-145细胞用含6 0mL/L牛血清的DMEM培养液复苏放大培养,当细胞量达到3×109时,接种入反应器中。先用细胞生长液培养,当细胞达到最大量时更换生长液为维持液,并接种HP-PRRSV。整个过程采用流加方式,每8h采样测定培养上清中葡萄糖浓度。接种病毒后,每24h测定培养上清HP-PRRSV滴度。6个批次细胞生长至88h,糖耗达到最高水平。连续3个批次种毒后培养至96h,上清中HP-PRRSV滴度达到最高,平均约为每106.4 TCID50/0.1mL。因此,认为应用激流式生物反应器进行细胞培养,通过过程工艺优化,可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产。     

我国高致病性猪繁殖与呼吸综合征研究进展

近年来我国学者对高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)做了大量调查研究,表明HP-PRRSV在我国已是长期带毒、持续流行状态,给我国养猪业带来巨大的经济损失,现就近期国内对该病的流行病学、诊断和免疫方面的相关成果作一综述。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒F株的分离鉴定

2012年2月,潍坊某猪场疑似发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)。病猪主要表现为呼吸困难,耳朵发绀,皮肤有弥漫性出血点;剖检发现淋巴结、肺脏出血严重。从病死仔猪脾、肺、淋巴结和脑组织中分离得到病毒。将该毒株在Marc-145细胞上盲传3代出现典型细胞病变,F3代病毒滴度为106.5TCID50/mL。RT-PCR检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性。用F3代毒株进行动物回归试验,结果符合高致病性PRRSV致病特征。上述结果证明该猪场发生的传染病为高致病性PRRS,并且利用Marc-145细胞成功分离到高致病性PRRSV,命名为F株。本研究为高致病性PRRSV致病特点及其疫苗研制提供物质基础。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引发高热综合征病因分析与防治措施

通过市场调研，分析了猪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起高热综合征的发病原因，提出防治措施，以供广大养殖户参考。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白质组双向电泳方法的建立及优化

为建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)蛋白质组双向电泳方法,本研究通过对HP-PRRSV蛋白样品提取、裂解、一向等电聚程序、上样量、染色试剂、显色时间等条件优化,建立了有效的HP-PRRSV蛋白质组学双向电泳方法。优化结果表明采用冻融-超声-裂解提取样品,结合2-D clean-up试剂盒纯化蛋白,按上样量为200μg,采用硝酸银染色,显色6 min,选择适宜的一向等电聚焦参数,能获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。HP-PRRSV蛋白质组双向电泳方法的建立,为开展该病毒蛋白质组和免疫蛋白质组研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和致病性沙门氏菌的混合感染

2003年9～11月某猪场发生母猪持续性繁殖障碍和7日龄仔猪呼吸困难、寒颤、下痢、体温升高和实质性器官出血为主要特征的疾病。3头发病仔猪的病变组织用RT-PCR检测。均为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性；由3头发病猪病料中所分离的细菌。可于普通琼脂、伊红美蓝和麦康凯琼脂培养基上生长，革兰氏染色阴性，形态与组织触片镜检及生化反应特性与沙门氏菌一致，可致死小鼠。仅对头孢唑啉呈中度敏感。结合该病的流行病学调查、临床症状、病理剖检，确诊为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和致病性沙门氏菌混合感染。     

PRRSV XH-GD株NSP7缺失感染性克隆的构建

PRRSV的非结构蛋白NSP7是病毒的一种高度保守的非结构蛋白,NSP7可以进一步水解产生NSP7α,NSP7β。目前对于NSP7的研究相对较少,对其生物学功能尚不清楚。为了进一步了解PRRSV NSP7对于病毒的复制的作用,本试验通过反向遗传平台在PRRSV XH-GD全长病毒骨架中分别对NSP7α,NSP7β,NSP7编码区进行缺失,构建NSP7以及NSP7部分缺失株的全长cDNA的重组质粒,并对构建的重组质粒进行病毒拯救。结果表明,对NSP7α,NSP7β,NSP7缺失对病毒的拯救是致死性的,推测NSP7对于病毒的复制具有重要作用,本研究结果对于NSP7的相关功能研究提供一定的参考依据。     

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组GP5蛋白的免疫原性,将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内,转染MDCK细胞,获得了重组病毒,免疫新生仔猪,分别在免疫后0～12周采集血清,通过ELISA检测证明,猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSVGP5的抗体.说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力.     

Recombinant Kluyveromyces lactis expressing highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 elicits mucosal and cell-mediated immune responses in mice

Currently, killed-virus and modified-live porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccines are used to control porcine reproductive and respiratory syndrome. However, both types of vaccines have inherent drawbacks; accordingly, the development of novel PRRSV vaccines is urgently needed. Previous studies have suggested that yeast possesses adjuvant activities, and it has been used as an expression vehicle to elicit immune responses to foreign antigens. In this report, recombinant Kluyveromyces lactis expressing GP5 of HP-PRRSV (Yeast-GP5) was generated and immune responses to this construct were analyzed in mice. Intestinal mucosal PRRSV-specific sIgA antibody and higher levels of IFN-γ in spleen CD4⁺ and CD8⁺ T cells were induced by oral administration of Yeast-GP5. Additionally, Yeast-GP5 administered subcutaneously evoked vigorous cell-mediated immunity, and PRRSV-specific lymphocyte proliferation and IFN-γ secretion were detected in the splenocytes of mice. These results suggest that Yeast-GP5 has the potential for use as a vaccine for PRRSV in the future.     

重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对高致病性PRRSV N蛋白基因表达的抑制作用

构建表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的siRNA重组伪狂犬病病毒3株,将其感染PK-15细胞,在细胞水平上评价重组伪狂犬病病毒介导的siRNA对N蛋白表达的抑制效果.PCR扩增带CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因,通过酶切将CMV-siRNA-poly(A)片段和新霉素基因分别插入伪狂犬病病毒转移载体pUSKBH中,构建重组伪狂犬病病毒通用转移载体pUsiRNA.分别用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切pUsiRNA,回收后与HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因的3个siRNA分子连接,构建表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒表达载体.将鉴定正确的重组伪狂犬病病毒表达载体与伪狂犬病病毒DNA共转染PK-15细胞,经同源重组及噬斑纯化获得表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒株,应用PCR及Southern blot鉴定重组病毒.将HN1株N蛋白基因的真核表达质粒pAcGFP1-N转染PK-15,经筛选获得稳定表达N蛋白基因的细胞.将鉴定正确的表达N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒接种于稳定表达N蛋白基因的细胞,利用绿色荧光蛋白基因及半定量RT-PCR检测重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA对N蛋白表达的抑制效果.结果显示,PCR扩增到的CMV-siR-NA-poly(A)片段约为0.7kb,新霉素基因约1.5kb.经酶切、PCR及测序鉴定,构建了表达siRNA的通用伪狂犬病病毒转移载体pUsiRNA.经PCR及Southern blot检测,获得了3株表达HP-PRRSV河南分离株HN1 N蛋白基因siRNA的重组伪狂犬病病毒gG-/siRNAN1、gG-/siRNAN2和gG-/siRNAN3;经荧光显微镜观察和半定量RT-PCR检测表明,重组伪狂犬病病毒介导的N蛋白基因siRNA能够显著抑制N蛋白在PK-15细胞中表达,其中gG-/siR-NAN2抑制效果最好.这为深入研究N蛋白基因siRNA抑制HP-PRRSV复制奠定基础,并为HP-PRRSV的防制提供新的思路.     

湖南高致病性猪蓝耳病隐性感染情况调查

用ELISA和RT-PCR的方法对采集自湖南省内20个规模场1007份血清和3个市级定点屠宰场50份猪肺门淋巴结进行蓝耳病血清抗体检测和高致病性猪蓝耳病病毒的检测。结果1007份血清中,蓝耳病抗体阳性率为72.9%(734/1007),高致病性猪蓝耳病病毒携毒率为3.2%(32/1007),50份肺门淋巴结病毒阳性率为16%(8/50),其中,蓝耳病免疫与非免疫猪血清其抗体阳性率相差不显著,种猪的抗体阳性率明显高于商品猪,而其病毒携毒率为0%。部分规模猪场和眼观健康的育肥猪存在高致病性猪蓝耳病病毒的隐性感染。