副猪嗜血杆菌检测技术的研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)病是近年来严重危害我国养猪业发展的新发细菌性传染病。对副猪嗜血杆菌的病原学、血清学、分子生物学检测技术进行大量研究,已建立了副猪嗜血杆菌的快速分离鉴定方法,但许多重要的领域还有待于深入研究。本文对副猪嗜血杆菌病相关检测技术及其研究进展进行综述。     

副猪嗜血杆菌相关毒力因子的研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus Parasuis,HPS)病是近年来严重危害我国养猪业发展的新发细菌性传染病。本文对副猪嗜血杆菌相关致病因子及其研究进展进行综述,重点介绍HPS上假定的hhdA和hhdB基因所编码的溶血素激活蛋白,进而对副猪嗜血杆菌相关毒力因子有新的认识。     

广东与四川地区发病猪副猪嗜血杆菌分离株omp5基因的克隆及序列分析

为了比较副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白P5(omp5)基因的同源性及抗原性,试验设计合成1对特异性引物,通过PCR方法从广东省和四川省发病猪的30株分离菌中扩增出HPS omp5基因,然后将PCR产物克隆至pMDTM18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,并进行序列测定与分析.结果表明:30株HPS omp5基因的完整序...     

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5基因的核苷酸序列,设计1对特异性引物,对贵州省HPS分离株OMP5基因进行扩增。结果表明所扩增的OIvIP5基因的长度为1116bp,与SH0165株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为lOO％。生物信息学分析结果表明,OMP5基因所编码的外膜蛋白P5的理论等电点pl为9．34不稳定系数为20．44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83．94,总体平均亲水性为-0．172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。     

副猪嗜血杆菌OMP5 基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank 上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5 基因的核苷酸序列,设计1 对特异性引物,对贵州省HPS 分离株OMP5 基因进行扩增。结果表明所扩增的OMP5 基因的长度为1116 bp,与SH0165 株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为100%。生物信息学分析结果表明,OMP5 基因所编码的外膜蛋白P5 的理论等电点pI为9.34,不稳定系数为20.44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83.94,总体平均亲水性为-0.172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21 个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22 个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆鉴定及序列分析

用PCR技术对华南地区分离的17株不同血清型副猪嗜血杆菌菌株ompP2基因进行克隆鉴定,并以CLUSTALS1和PHYLIP-3.68软件将ompP2基因序列进行比对和遗传进化分析.17株副猪嗜血杆菌茵株中均能扩出ompP2基因,克隆测序结果发现ompP2基因大小有所不同,与参考序列ABKM01000007的同源性在92％～99％之间.序列比较结果显示,ompP2基因与GenBank公布的副猪嗜血杆茵全基因组测序中的ompP2基因序列具有较高的同源性,不同菌株ompP2基因序列大小存在差异,为进一步验证ompP2蛋白的功能及相关研究奠定了基础.     

副猪嗜血杆菌OmpP2基因的克隆及生物学信息分析

为了研究副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2基因的结构特征及编码蛋白的功能,根据GenBank中HPS OmpP2基因的DNA序列设计引物,以HPS血清13型江西分离株的基因组为DNA模板,利用PCR扩增OmpP2基因,并将其克隆到pMD18-T载体,进行测序及生物信息学分析。结果表明,此序列编码364个氨基酸,与GenBank上登录的OmpP2序列核苷酸同源性为98.7%~100%,其中与湖北F641株的同源性最高,达到100%;蛋白质的分子理论值为39.14ku,理论等电点为9.14;第1位~第20位氨基酸残基组成信号肽,属于分泌型蛋白;所编码的蛋白属于亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。研究获得了HPS OmpP2基因,为今后研究此基因的生物学功能奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌OMP2基因的克隆及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌（HPS）全基因组序列中的外膜蛋白OMP2基因的核苷酸序列,利用Premier Primer5.0和Oligo6.0软件设计1对特异性引物,对从贵州省分离的HPS的OMP2基因进行扩增、克隆、测序和生物信息学分析。测序结果比表明,扩增的HPS分离菌株目的基因长度为1092bp,共编码363个氨基酸,与GenBank上公布的SH0165株（NC₀11852）中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性100%。生物信息学分析结果表明,OMP2外膜蛋白的分子质量为39087.45Daltons,理论等电点pI为9.21,不稳定系数为16.73,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为70.63,总体平均亲水性为-0.494,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈散在分布,有8个主要的抗原表位;OMP2外膜蛋白序列最前端的19个N-末端氨基酸残基为信号肽序列,最佳切割位点在19～20个氨基酸,且信号肽区域主要为疏水性氨基酸;该蛋白无跨膜区;预测OMP2外膜蛋白可能含有4个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、7个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、9个N-肉豆蔻酰化位点。     

副猪嗜血杆菌thyA基因的序列分析

为探究副猪嗜血杆菌thyA基因的遗传特性,针对于分离的副猪嗜血杆菌辽宁分离株的thyA基因进行测序,并运用软件对基因序列及氨基酸序列的同源性等进行分析研究。结果显示,thyA基因在副猪嗜血杆菌辽宁株亲缘性较高,其中基因序列与已公布的参考菌株同源性为95.7%~100%,氨基酸序列同源性为97.2%~100%,预测thyA基因编码蛋白的三级结构,发现thyA毒力基因在副猪嗜血杆菌中保守存在,为揭示thyA基因在副猪嗜血杆菌中功能奠定了一定基础。     

副猪嗜血杆菌广西分离株耐药性分析

为了了解广西副猪嗜血杆菌(HPS)的耐药情况,试验应用纸片扩散法测定了2009年5月份至2011年3月份分离自广西壮族自治区南宁、桂林、玉林、钦州市65个猪场的31株副猪嗜血杆菌药物敏感性。结果表明:31株菌株对罗红霉素、多黏菌素B和链霉素的耐药率为58.1%、54.8%和51.6%;对头孢西丁、阿莫西林、氨苄西林、卡那霉素、阿米卡星、新霉素、环丙沙星、恩诺沙星的耐药率为16.1%～41.9%;对庆大霉素、氟苯尼考和头孢噻肟的耐药率只有6.5%、9.7%和9.7%。在31株HPS广西分离株中,只有1株菌株对14种抗菌药敏感,仅占3.2%;4株菌株只对1种抗菌药产生耐药性,占12.9%;其余26株菌株对2种以上抗菌药产生耐药性,占83.6%。     

副猪嗜血杆菌OMP P2基因的克隆与表达

利用已分离的菌株HB070412,根据NCBI上GenBank中的HPS序列（ZP_02477753）设计了1对引物,用PCR方法扩增了副猪嗜血杆菌外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2基因（OMP P2）,并克隆到载体pMD18-T（T-Vec-tor）,序列测定结果表明OMP P2基因全长1 077bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与所报道的HPS OMPP2基因之间的核苷酸序列同源性为98.1%,氨基酸序列同源性为95.5%。用pGEX-6p-1构建了原核表达载体pGEX-P2,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的50%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约为65 000,Western blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。     

副猪嗜血杆菌血清4型全基因组序列草图测定与分析

本研究应用Illumina Hiseq 2000测序系统对副猪嗜血杆菌(HPS)血清4型gx033株进行全基因组序列测定,经过DNA文库构建、测序、数据过滤和组装,绘制了全基因组草图.全基因组草图显示,HPS血清4型的基因组大小为2 155 493 bp,G+C含量为39.79％,含有编码基因2 189个,基因总长度1 881 801 bp.基因功能注释表明,849个基因功能尚不明确,1 340个基因被分为能量产生和转化、转录和细胞周期调控等19个功能组.该HPS血清4型全基因组草图的绘制为HPS病的致病机制等研究提供依据.     

副猪嗜血杆菌S-核糖基高半胱氨酸酶基因序列分析与推导蛋白三维结构的分子模拟

利用PCR方法获得副猪嗜血杆菌S-核糖基高半胱氨酸酶(luxS)基因全长DNA,将PCR纯化产物与pMD18-T载体连接并转化E.coil DH5α菌株,重组阳性质粒测序并采用生物信息学软件对所推导的氨基酸序列进行三维结构分析。结果表明,该基因全长510bp,并与GenBank中登录的其他5株菌株luxS基因完整参考序列进行比较,同源性均在70%以上。用ExPAsy软件包预测了推导蛋白的特性,运用Swiss-PDB viewer软件的SWISS-Model处理器,并利用同源建模的思想建立HPS-luxS的三维结构。拉马钱德兰图证明,构建的luxS蛋白的空间结构是合理的。     

广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡白细胞介素2基因序列设计一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡的外周血淋巴细胞RNA中扩增,均得到大小为470 bp的特异性片断。将10个品种鸡的RT-PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上,得到重组质粒,经PCR和EcorⅠ、SalⅠ双酶切等方法鉴定后,测定鸡白细胞介素2基因序列。序列分析结果表明:广西10个地方优质品种鸡白细胞介素2基因都编码143个氨基酸的成熟蛋白,分子量约为16.3 ku,与哺乳动物和其他品种鸡核苷酸序列的同源性分别为24.8%-30.3%、98.8%-99.8%,氨基酸的同源性为14.6%-16.7%、96.5%-98.6%。     

广西地区副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱分型研究

为探讨肠道细菌基因间重复序列(ERIC)的聚合酶链反应(PCR)技术用于副猪嗜血杆菌基因分型的可行性,对分离自广西地区不同猪场的22株副猪嗜血杆菌进行ERIC-PCR指纹图谱分型研究.结果发现,22株分离株显示出12种指纹图谱,可以区分无法进行血清分型的菌株.表明ERIC-PCR可适用于对副猪嗜血杆菌进行分子流行病学调...     

广西10个地方优质品种鸡γ-干扰素基因的克隆与序列分析

根据基因库中鸡γ-干扰素的基因序列设计了1对特异性引物，应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从ConA诱导培养的广西10个地方优质品种鸡外周血淋巴细胞RNA中扩增了γ-干扰素基因，结果，均得到了大小为520 bp的特异性片段。将扩增产物纯化并克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒，经PCR和EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切鉴定后测序。序列分析结果表明，广西10个地方优质品种鸡γ-干扰席基因均编码145个氨基酸的成熟蛋白，分子质量约为16．8ku，与哺乳动物和其他品种鸡的核苷酸序列同源性分别为38．8％～39．0％和99．2％～100％，氨基酸序列同源性分别为23．69／6～24．8％和97．6％～99．4％。     

副猪嗜血杆菌Plp4蛋白的原核表达及免疫原性分析

为原核表达副猪嗜血杆菌P1p4蛋白,本研究通过PCR方法扩增P1p4全长基因并克隆于pET-28a(+)载体中,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态中,采用0.4 mM IPTG经22℃诱导表达了35 ku的重组蛋白.经western blot试验证明Plp4蛋白具有良好的反应原性,免疫6周龄昆明小鼠制备免疫血清,ELISA检测表明制备的抗血清效价在1∶15000以上,表明P1p4蛋白具有良好的免疫原性.     

水貂铜绿假单胞菌鞭毛分型及分离株flic基因的克隆与序列分析

为分析铜绿假单胞菌(PA)分离株鞭毛蛋白基因(flic)之间的差异,本研究通过PCR方法扩增由山东地区发病水貂的肺脏组织中分离的29株分离株flic基因的部分片段,根据其片段长度确定PA的鞭毛类型。选取两种类型代表株(PASD01、PASD03),采用PCR方法扩增flic全基因进行序列分析。结果表明,PASD01分离株与国外A型PA flic基因序列同源性为99.6%～99.7%,PASD03分离株与B型PA flic基因的序列同源性为98.9%～99.5%,而两个分离株之间的序列同源性为76%。本研究首次从水貂病变组织中克隆得到两种鞭毛蛋白类型的flic基因,该基因在各型鞭毛菌株中高度保守,为进一步研制鞭毛亚单位疫苗提供实验依据。     

规模化猪场副猪嗜血杆菌的部分生物学特性研究

为了查明流行于新疆北部部分地区部分规模化养猪场副猪嗜血杆菌的存在情况及其部分生物学特性,本试验以新疆北部地区几个规模化猪场为研究对象,从可疑副猪嗜血杆菌病病料中分离目标菌,采用微生物学与免疫学的试验手段,调查其主要流行株的生物学特性,包括生理生化特性、培养特性及分子特性,并对分离株进行了药敏试验及对小白鼠的致病性试验。试验结果表明,该地区规模化猪场中已普遍存在副猪嗜血杆菌病的感染,5株分离株对小白鼠均有较强的致病性,而且对硫酸庆大霉素和盐酸土霉素已经产生了耐药性。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.