白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.     

白细胞介素-2对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响

为研究白细胞介素-2(IL-2)对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响,选择40只幼犬,随机分成试验组和对照组,试验组按0.5 ml/头份加入犬用IL-2与犬细小病毒疫苗一起皮下注射,对照组单独使用犬细小病毒疫苗,注射后分别在接种前、接种后7 d和14 d使用金标试纸条检测其抗体效价,并进行组间抗体效价差异的t检验。试验结果表明,接种疫苗前试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价之间差异不显著;接种疫苗后7 d,试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价差异极显著(P<0.01);接种疫苗后14 d,试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价差异极显著(P<0.01)。试验表明:IL-2可明显提高幼犬对犬细小病毒疫苗的抗体应答能力,是一种良好的犬细小病毒疫苗候选佐剂。     

白细胞介素 2对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响

为研究白细胞介素 2（IL-2）对犬细小病毒疫苗免疫效果的影响,选择40只幼犬,随机分成试验组和对照组,试验组按0.5 ml/头份加入犬用IL-2与犬细小病毒疫苗一起皮下注射,对照组单独使用犬细小病毒疫苗,注射后分别在接种前、接种后7 d和14 d使用金标试纸条检测其抗体效价,并进行组间抗体效价差异的t检验。试验结果表明,接种疫苗前试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价之间差异不显著;接种疫苗后7 d,试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价差异极显著(P<0.01);接种疫苗后14 d,试验组与对照组犬细小病毒平均抗体效价差异极显著(P<0.01)。试验表明：IL 2可明显提高幼犬对犬细小病毒疫苗的抗体应答能力,是一种良好的犬细小病毒疫苗候选佐剂。     

猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍性疾病的主要病原之一,该病毒在世界范围内广泛存在并呈地方性流行, 给生猪的繁殖、发展带来了巨大的经济损失,故防制猪细小病毒病非常重要。PPV VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,在体外能自我装配成病毒样颗粒,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,且可作为抗原转运载体,所以研究VP2对PPV新型疫苗研制至关重要。文章综述了猪细小病毒结构蛋白VP2及其疫苗的研究进展。     

犬细小病毒VP2蛋白特点及病毒样颗粒疫苗制备研究进展

犬细小病毒病危害犬的健康,传统疫苗不能有效保护犬免受病毒的侵扰,寻求新的疫苗是当前研究和关注的热点。VP2蛋白是犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)的主要保护性抗原蛋白,在决定宿主范围和入侵过程中起重要作用。此外,VP2蛋白在N-端结构域和环结构域中含有几个重要的B细胞表位,可在CPV感染过程中诱导产生有效的中和抗体。因此,在开发CPV基因组亚单位疫苗中,VP2蛋白可作为候选抗原的首选。病毒样颗粒(VLPs)与天然病毒相似,但不具备天然病毒的复制功能引起机体发生感染,故近几年来利用不同的表达系统组装VP2蛋白一直是研究者们研究的重点。笔者着重对CPV VP2蛋白的特点及构象进行分析,通过特点分析得知CPV衣壳的主要成分中含有VP2,不但具有血凝活性,还与CPV的宿主范围和抗原性密切相关,因此,有活性的VP2蛋白在CPV基因工程亚单位疫苗的开发中极其重要。通过构象分析得知CPV VP2蛋白环状结构(Flexible loop)具有更大的灵活性,这可能是CPV感染宿主范围不断扩大的分子基础。同时笔者对VLPs疫苗的制备方法及优缺点进行讨论,以期为CPV疫苗的研究制备提...     

白细胞介素—3对猪瘟病毒E2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明系小白鼠为试验动物,观察了白细胞介素－３（ＩＬ－３）对猪瘟病毒Ｅ２囊膜糖蛋白（ＨＣＶ Ｅ２）基因疫苗免疫效果的增强作用。用ＤＮＡ重组技术将ＨＣＶ Ｅ２基因和白小鼠ＩＬ－３基因克隆到ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ质粒,因在两者之间有脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ）的核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）片段,可得到ＨＣＶ Ｅ２抗体效价。结果显示,ＩＬ－３能显著提高ＨＣＶ Ｅ２基因疫苗的免疫效果,表明ＩＬ－３可作为ＨＣＶ Ｅ２     

猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及免疫原性

将PPV VP2基因酶切后克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)中,构建pcDNA-VP2,经脂质体法转染IBRS-2细胞后,Western blotting检测pcDNA-VP2能正常表达.采用 pcDNA-VP2肌注Balb/c小鼠,作间接ELISA抗体检测试验,并采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测.结果表明,pcDNA-VP2能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答.PCR扩增检测结果显示,未能从免疫小鼠各组织的基因组中扩增出VP2基因片段.     

犬细小病毒VP2基因的比较及分型研究

为查明我国CPV的流行变异情况及为进一步的免疫研究奠定基础,对我国不同地区分离到的9株细小病毒毒株进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与CPV的参考毒株进行了比较分型, 9 株CPV 中有6 株属CPV 2a,3株属CPV 2b,但未分离到CPV 2c变异株,结果表明我国目前仍以CPV 2a流行为主。     

云南省犬细小病毒VP2基因检测分析

为了解云南省犬细小病毒VP2基因分子流行变异情况,对来源于云南省7个地级市13个犬细小病毒样品进行了VP2基因的扩增和序列分析,并与相关参考序列进行了遗传进化比对分析。结果表明,13个样品中9个基因型为CPV-2a,3个基因型为CPV-2b,1个基因型为CPV-2。氨基酸序列变异主要集中在297位-518位氨基酸处,其中324位和440位氨基酸变异在犬细小病毒进化过程中扮演着重要角色。遗传进化分析显示10个样品序列形成了一个相对于国内外参考序列独立的遗传进化分支,提示云南省犬细小病毒以CPV-2a基因型流行为主。     

Development of a DNA vaccine against chicken anemia virus by using a bicistronic vector expressing VP1 and VP2 proteins of CAV

In the present study, we describe the development of a DNA vaccine against chicken anemia virus. The VP1 and VP2 genes of CAV were amplified and cloned into pBudCE4.1 to construct two DNA vaccines, namely, pBudVP1 and pBudVP2-VP1. In vitro and in vivo studies showed that co-expression of VP1 with VP2 are required to induce significant levels of antibody against CAV. Subsequently, the vaccines were tested in 2-week-old SPF chickens. Chickens immunized with the DNA-plasmid pBudVP2-VP1 showed positive neutralizing antibody titer against CAV. Furthermore, VP1-specific proliferation induction of splenocytes and also high serum levels of Th1 cytokines, IL-2 and IFN-γ were detected in the pBudVP2-VP1-vaccinated chickens. These results suggest that the recombinant DNA plasmid co-expressing VP1 and VP2 can be used as a potential DNA vaccine against CAV.     

犬细小病毒VP2截短基因的原核表达及表达蛋白抗原性分析

采用PCR方法扩增了犬细小病毒（Canineparvovirus,CPV）2段VP2截短基因,将2段短基因片段分别克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,表达质粒命名为pET-32a-306和pET-32a-363。将pET-32a-306和pET-32a一363转化至宿主菌E．coliBL21（DE3）,IPTG诱导后进行SD孓PAGE和Westernblotting分析。结果显示,融合蛋白相对分子质量大小为30000和33000;与全长VP2蛋白相比,目的蛋白得到了高效表达,且都为可溶性表达。West—ernblotting结果表明,该蛋白融合表达并且有很好的免疫反应原性,可为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究提供候选抗原。     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序，并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示，获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因，序列全长1755bp，编码584个氨基酸；B细胞表位主要位于VP2蛋白第1～38、73～83、86～104、152～195、235～243、294～326、347～400、404～416、469～483、503～521和571～585区段。表明，犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位，这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

稳定表达犬细小病毒VP2结构蛋白的CHO-K1细胞系的建立

为构建犬细小病毒VP2基因分泌性表达细胞系,通过酶切将人CD5信号肽序列从质粒中切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp载体中CD5信号肽的下游,使其与CD5信号肽序列融合,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经脂质体介导转染细胞,后通过G418筛选,建立出稳定表达VP2蛋白的CHO-K1细胞系。测序结果表明,构建的犬细小病毒VP2基因的分泌型表达载体结构正确,表达载体经脂质体介导转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出稳定转染VP2基因的细胞株,经PCR检测证明VP2基因已经整合到细胞的染色体中;经RT-PCR、Westernblot分别检测VP2基因表达的mRNA和VP2蛋白,证明犬细小病毒VP2基因能够在CHO-K1细胞进行稳定性表达。这为下一步研究犬细小病毒VP2蛋白与宿主细胞的相互作用及VP2DNA疫苗奠定了基础。     

水貂阿留申病毒部分VP2基因的原核表达及免疫学分析

利用PCR技术扩增出水貂阿留申病毒(ADV)含有VP2抗原表位区的基因片段,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组质粒pGEX-4T-VP2,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG法进行诱导表达。经SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹分析显示有目的条带,并且在诱导6 h后表达量达到最高,随时间的延长表达量降低。本研究成功构建了pGEX-4T-VP2重组质粒,确定了VP2基因的优化表达条件,为阿留申病的免疫学诊断和疫苗研制奠定基础。     

犬细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立与评价

通过序列比对和Blast分析,选定犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白保守区基因为检测的目的基因,引物采用Primer Premier 5.0软件设计。利用灵敏度较高的TaqMan探针法建立CPV核酸检测方法。通过对标准品的扩增、测序及对标准扩增曲线的绘制,建立CPV核酸检测方法。同时对建立的检测方法进行了检测特异性、灵敏度和重复性分析。将阳性对照标准品进行10倍梯度稀释后可检测到102拷贝/μL样品,表明该检测体系具有较高的检测灵敏度。通过分析表明,本检测方法在用空白对照及类似的猪细小病毒、猪圆环病毒作为扩增对照时,没有发现非特异性产物的产生,表明该体系对于CPV的检测是特异的。通过6次批间重复检测,体系的变异系数小于3%,表明该检测体系具有良好的重复性。     

广州地区犬细小病毒VP2基因的序列分析

犬细小病毒病是一种高度接触性传染病,临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。为研究广州地区犬细小病毒病的流行亚型,本试验采集2011—2012年间疑似病犬粪便,进行犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）分离鉴定,提取病毒基因组进行VP2基因扩增和序列分析,与GenBank中登录的参考毒株进行比对,结果发现,分离的8株CPV中SCAU-5为CPV-2b 亚型,其余为CPV-2a亚型。结果表明,2011—2012年间广州地区的流行毒株以CPV-2a亚型为主。     

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变（CPE）,分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。