细菌单杂交方法在筛选甲基营养菌甲醇脱氢酶启动子结合蛋白中的应用

为了构建甲基营养菌转录因子亚文库及筛选与甲醇脱氢酶启动子DNA相互作用的蛋白质,对甲基营养菌MP688的基因组和转录组数据进行分析,使用关键词对全基因注释信息和转录组结果进行搜索,找到相关基因的核苷酸序列,通过PCR获得目的片段并构建一系列转录因子亚文库,利用细菌单杂交系统筛选转录因子亚文库找到与甲醇脱氢酶启动子具有相互作用的调控因子。成功构建完成含有32个转录因子的亚文库,建立了甲基营养菌中细菌单杂交筛选方法,通过该方法筛选出2个与甲醇脱氢酶启动子具有强相互作用的转录因子基因。对于基因组已测序的细菌来说,构建转录因子亚文库筛选效率要优于构建基因组文库和cDNA文库,细菌单杂交系统能成功用于甲基营养菌,并能快速高效地筛选与启动子具有相互作用的转录因子。这一方法的建立,为阐明甲醇脱氢酶在甲基菌生长和代谢产物合成中的调控机制奠定了基础。     

百脉根结瘤信号通道蛋白NSP1和NSP2的转录激活作用

共生结瘤过程是根瘤菌与宿主植物交换信号分子的相互作用过程,结瘤信号通道蛋白基因NSP1和NSP2是结瘤因子诱导的共生信号转导途径的必要元件。LjNSP1和LjNSP2蛋白都包含植物所特有的GRAS结构域,推测为转录调节子,但缺乏明确的生化证据。为验证这一推测,本研究采用酵母双杂交系统,将两者分别融合到酵母GAL4转录因子的DNA结合结构域上,根据是否能激活报告基因的表达来验证它们的转录激活能力。结果表明LjNSP1和LjNSP2在酵母体内均具有转录激活的能力。为进一步确定转录激活的区域,对LjNSP1和LjNSP2构建了一系列的缺失突变,鉴别出转录激活区段均位于两者的N-末端的可变区域。为验证作为转录因子的LjNSP1和LjNSP2是否具有结合某种特定基因的启动子的能力,进行了酵母单杂交实验。其结果表明,LjNSP1和LjNSP2蛋白均能够结合根瘤起始基因NIN的启动子,但不能结合钙离子结合蛋白基因CBP1的启动子。     

紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术及其应用

紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术(UV laser crosslinking and chromatin immunoprecipitation,UV-X-ChIP)是研究蛋白质与DNA的相互作用及鉴定转录因子靶DNA的一条新途径。该技术结合DNA芯片、Southern杂交及DNA文库的构建可用于研究蛋白质与DNA的相互作用及高通量筛选已知转录因子在全基因组范围内的结合位点,这为转录因子调控网络的绘制奠定基础。笔者对紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术及应用作一综述。     

梭梭NAC转录因子HaNAC38功能及特性分析

从梭梭干旱转录组中获得与干旱相关的NAC转录因子基因HaNAC38，为了研究其功能，以过表达HaNAC38基因拟南芥纯合株系作为对象，比较转基因株系与野生型间的差异，并利用酵母单杂交技术对HaNAC38转录因子可能结合的DNA核心序列进行验证。结果表明，在自然干旱和模拟盐胁迫条件下，过表达HaNAC38基因拟南芥株系生长状况显著优于野生型拟南芥。过表达HaNAC38基因拟南芥株系的种子发芽率、幼苗叶片脯氨酸含量及过氧化氢酶活性均显著高于野生型拟南芥株系，丙二醛含量和过氧化氢含量显著低于野生型拟南芥。由此表明HaNAC38显著增强了拟南芥对于干旱和盐胁迫的耐受能力。酵母单杂交试验结果表明，HaNAC38转录因子可以在酵母体内特异性结合TTGCGT核心序列，并激活下游报告基因的表达。以上结果为明确梭梭HaNAC38转录因子的功能及其调控网络奠定了基础。     

胡杨中两个新DREB类基因的克隆、序列分析及转录激活功能研究

DREB转录因子(干旱应答元件结合因子)是逆境适应中的关键调节因子。该类转录因子的特点是拥有保守的AP2/EREBP(APETALA2/乙烯应答元件结合蛋白)结构域,能够特异性地与抗逆基因启动子上的DRE元件相结合,在低温、干旱和盐碱等条件下调节一系列下游逆境应答基因的表达。本研究从胡杨中分离出2个编码DREB2类蛋白的基因PeDREB3和PeDREB4。PeDREB3和PeDREB4在胡杨根、茎、叶中都有表达。序列分析显示,PeDREB3和PeDREB4均含有非典型性AP2/ERF结构域,即在AP2/EREBP结构域的第2个β折叠和第3个β折叠处多出8个氨基酸残基,用改进的酵母单杂交技术发现PeDREB3和PeDREB4能够在酵母中激活下游报告基因的表达,具有转录活性。     

桃树PpGL2转录因子基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆桃树同源异型—亮氨酸拉链(HD-ZIP)基因(PpGL2),并对其进行生物信息学分析,为研究HD-ZIP转录因子在植物生长发育过程中的调控机制提供理论依据.[方法]采用RT-PCR从桃树品种春喜中克隆Pp-GL2基因的开放阅读框(ORF)全长,对其进行序列分析,并构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的分布情况;同时利用酵母单杂交方法检测其转录活性和DNA结合位点及活性.[结果]从桃树幼叶中克隆获得PpGL2基因,其ORF全长为2253 bp,编码750个氨基酸,以碱性氨基酸较多,含典型的START结构域,属于HD-ZIP转录因子家族的Ⅳ亚族,是一种核定位蛋白.PpGL2转录因子与核桃、可可、苹果等HD-ZIP转录因子的氨基酸序列同源性均在84.60%以上,其中与苹果HD-ZIP转录因子(XP_008384034.1)的同源性最高,为92.41%,表明不同物种的HD-ZIP转录因子氨基酸序列高度保守.PpGL2在酵母细胞中具有转录活性和DNA结合活性,可特异性结合回文序列CAATAATTG.[结论]PpGL2转录因子属于HD-ZIP转录因子家族的IV亚族,定位于细胞核,与DNA的结合位点是回文结构CAAT(A/T)ATTG,可能参与调节桃树的生长、发育及抗逆性等重要生理过程.     

酵母单杂交技术的原理及应用

酵母单杂交技术是一种体外分析DNA与蛋白质相互作用的技术。文章就酵母单杂交技术的原理、操作步骤、应用及其优缺点作了简要概括。     

酵母双杂交技术研究与应用进展

酵母双杂交是利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的非常有效的一种分子生物学技术,被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域,已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一,获得了许多有价值的重要发现。随着分子生物学的发展,在酵母双杂交的基础上又建立起了酵母单杂、反向双杂交、三杂交及核外双杂交等多项技术,并已经成功地运用于蛋白质之间、蛋白质与DNA、RNA和配体之间相互作用的研究。对酵母双杂交及其相关技术与应用研究进展进行了综述。可以预见,在人类、水稻和拟南芥等模式生物基因组测序完成后,酵母双杂交及其衍生技术将在功能基因组学和蛋白质组学的研究中发挥越来越重要的作用。     

牡丹抗逆转录因子基因PsDREB的功能解析

通过酵母单杂交试验,对牡丹抗逆转录因子基因PsDREB的DNA结合能力及转录激活功能进行分析。结果显示:PsDREB蛋白能够特异性地与顺式作用元件DRE(dehydration responsive element,干旱应答元件)结合,但不能与突变的DRE(mDRE)结合;该蛋白能够激活下游报告基因His的表达,从而使酵母细胞在缺失His的培养基上能够正常生长。说明PsDREB具有转录激活功能。为了进一步研究该转录因子基因PsDREB在植物抗逆反应中的功能,利用农杆菌介导法将其转化到模式植物烟草中,对获得的转基因烟草进行低温、干旱、高盐、脱落酸等胁迫处理。结果发现:与对照相比,超量表达PsDREB基因能够明显提高烟草对逆境胁迫的抗性,尤其是在抗干旱和高盐方面效果显著。     

染色质免疫沉淀技术（ChIP）在基因转录调控中的作用

目的研究体细胞水平蛋白（转录因子）与DNA（靶基因启动子区）的相互作用.方法用甲醛固定活细胞,在生理状态下,结合的蛋白质-DNA复合物呈交联状态,超声将DNA打断成不同大小的片段,用目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物,复合物65℃解交联,并分离纯化DNA,然后进行PCR扩增.结果PCR扩增出阳性条带.结论ChIP是一项在不同生理条件下探测转录因子与DNA结合的成熟技术.     

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域（含有R2R3结构域）和C端区域（不含R2R3结构域）,检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD₆₀₀值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。     

分子标记技术在番茄抗性育种中的应用

介绍了DNA分子标记的各种类型,RFLP、RAPD、SSR、AFLP和SNP标记是植物遗传作图最常用的,介绍了各种类型的使用范围以及优点和缺点。综述了近年来DNA分子标记技术在番茄抗性育种中的应用,包括耐冷性,耐盐性,抗病性,抗虫害等方面的应用,并就今后番茄分子育种主要研究方向进行了讨论。     

植物抗病性研究现状与前景展望

植物抗病性是当前植物病理学中研究的热点和难点之一 ,也是植物 -病原物互作及植物免疫学研究的一个重要方面。植物抗病基因的克隆与鉴定促进了植物抗病性分子机制的研究。本文就近几年来对植物抗病性的鉴定方法、植物结构抗性、生理生化抗性及分子抗性三种水平的抗病机制与抗病基因工程等方面的研究进展作一简要概述。     

菠萝品种选育与栽培技术研究进展

对菠萝品种选育与栽培技术研究进展进行概括,包括菠萝种质资源收集评价、杂交育种、诱变选种、基因工程育种研究,以及菠萝种苗繁育、生产种植、催花、防寒防晒等栽培技术研究的新进展。此外,对未来菠萝育种研究与栽培技术研究主要方向进行展望。在菠萝种质资源精准评价的基础上,建立以常规杂交育种、诱变育种为主体,基因工程育种为辅助的育种体系是菠萝育种研究的主要方向。开展菠萝“黑心病”和“水菠萝”发生的机理研究,从生产源头降低“黑心病”和“水菠萝”发生的栽培技术措施研究,以及无损检测技术与智能化、省力化种植技术研究等是国内菠萝高效栽培技术研究的主要内容之一。     

酵母SOD1基因缺失突变体应答真菌细胞壁抑制剂CFW的转录组学分析

以酿酒酵母为研究材料,采用酵母全基因组表达谱芯片,分析超氧化物歧化酶SOD1基因缺失(sod1Δ)对酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂钙荧光白(CFW)全基因组转录表达谱的影响,为揭示植物病原真菌细胞壁调控机制以及植物抗真菌基因工程改造提供新的理论基础。结果表明:CFW(10μg/m L)处理1 h后,与野生型酵母细胞相比,sod1Δ酵母细胞中211个基因发生了显著差异表达(97个基因表达上调、114个基因表达下调)。随机选取5个差异表达基因采用定量PCR验证,结果与芯片分析结果一致。差异表达基因功能主要涉及细胞壁、细胞代谢、蛋白质合成、细胞防御以及大量功能未知蛋白。以上结果表明,SOD1基因缺失可显著改变酵母细胞应答真菌细胞壁抑制剂CFW胁迫的全基因组转录表达谱。     

油葵种子DNA提取和RAPD反应体系的优化

[目的]为利用RAPD技术进行油葵的亲缘关系分析及杂种鉴定奠定基础。[方法]以6种杂交油葵种子为试材,采用改良的CTAB法提取油葵基因组DNA,并对提取DNA的浓度和纯度进行测定。通过单因子梯度试验,筛选出优化、稳定的RAPD-PCR反应体系。[结果]采用改良CATB法提取的油葵DNA质量好、得率高,且无蛋白质和酚类的污染。油葵的最适RAPD-PCR反应体系为:2.0μl 10×Buffer、2.0 mmol/L Mg2+、150μmol/LdNTPs、1.5UTaq酶、2.0 ng/μl DNA模板、0.25μmol/L引物,总体积为20.0μl。利用该体系对不同含油量的6个油葵杂交种进行扩增,均表现为带形清晰稳定、带数适宜。[结论]该RAPD技术体系适用于各种油葵杂交种的DNA分析。     

bZIP转录因子与植物抗逆性研究进展

碱性亮氨酸拉链(Basic region/leucine zipper motif,bZIP)类转录因子是近年来研究较多的转录因子家族之一,参与多种生物学过程,对植物的抗病性、抗寒性、抗旱性和耐盐性等逆境均具有重要的调控作用.文章通过对植物bZIP类转录因子的分布、结构、分类及其在植物逆境胁迫中的作用等最新研究进展进行了综述,提出今后可在全基因组层面上发掘更多的bZIP转录因子,并通过定点突变、转基因等手段创造bZIP的突变体,促进对bZIP表达调控机制的认识,进而了解bZIP转录因子对抗逆相关基因的调控机理,并通过基因工程手段提高植物的抗逆性,培育多抗性植物新品种.     

转基因玉米研究进展

植物转基因技术开辟了作物遗传改良的新途径。转基因玉米是植物基因工程领域研究的热点之一。近年来,应用转基因技术已经获得抗虫、抗除草剂和其他有用性状的转基因玉米。在此,就玉米转基因在受体系统、目的基因及转化方法方面的研究成果,尤其是近年来玉米转基因研究方面存在的问题、解决途径以及其他类型玉米的转基因研究进展做了综述。     

基因工程在植物根结线虫防治中的应用

综述基因工程在植物根结线虫防治中的应用。介绍了利用基因工程获得抗虫植物,实现对根结线虫防治的策略：植物抗体策略,蛋白酶抑制剂策略,抗线虫取食位点策略,抗虫基因的克隆以及RNAi技术的利用等。展望了抗虫基因的克隆和RNAi技术在根结线虫防治方面的研究前景。     

中晚熟玉米杂交种酒单125选育报告

玉米新杂交种酒单125是酒泉市农业科学研究所以酒256为父本,ZPL717—2为母本组配而成,生育期137d,属中晚熟,株高290cm,株型紧凑,籽粒淡红色马齿型,含粗蛋白16．63％、粗脂肪3．90％、淀粉70．84％、赖氨酸0．33％,根系发达,抗倒伏,生育后期持绿性较好,高抗丝黑穗病,抗瘤黑粉病。适宜在甘肃河西地区覆膜种植,也可在中东部干旱地区及相似生态区种植。