牛整合素α4亚基片段的原核表达及抗体制备

参照GenBank中牛整合素α4基因序列,合成了牛整合素α4亚基753bp（192～944nt）的cDNA片段,克隆至原核表达载体pET-28a（＋）中,转化入BL21,IPTG诱导表达。表达产物经Western blot鉴定,结果表明成功表达了相对分子质量约为30 000的α4蛋白。超声破碎细菌后,目的蛋白主要以包涵体形式存在。蛋白纯化后进一步复性,免疫大鼠获得多抗,间接ELISA检测多克隆抗体效价为1∶32 000。这为进一步研究牛整合素α4β7的功能奠定了基础。     

牛整合素β1亚基在COS-7细胞中的真核表达

整合素是由18种α亚基和8种β亚基在细胞表面形成的异型二聚体。研究发现,整合素β1亚基是粘附分子家族主要成员,对多种细胞的存活、扩增、迁移有重要作用。本研究通过设计针对牛整合素β1亚基的特异性引物,将其克隆到真核表达载体pEYFP-C1上,构建p EYFP-C1-β1重组表达质粒,经PCR和酶切鉴定符合试验预期的阳性重组质粒与脂质体按照1:1.5比例共转染COS-7细胞,48 h后可见阳性重组质粒共转染COS-7细胞出现荧光信号。结果表明,本研究成功构建出具有生物学活性的牛整合素β1亚基,为研究牛整合素β1亚基的生物学功能奠定基础。     

牛胎儿成纤维细胞的培养及性别鉴定

为了探索和建立牛胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,试验取自怀孕40 d的奶牛胎儿耳组织用组织块贴附法进行原代培养和传代培养,用倒置相差显微镜观察成纤维细胞形态;根据牛Y染色体上的性别决定区域(SRY)基因序列设计合成1对PCR引物作为性别鉴定引物, 同时根据牛403 bp的β-珠蛋白基因序列设计1对引物作为内参照引物,建立PCR 反应体系进行性别鉴定.结果表明:分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖;阳性对照和第1牛胎儿成纤维细胞系PCR鉴定扩增得到255 bp的片段和403 bp的β-珠蛋白基因片段,第2,3牛胎儿成纤维细胞系和母牛血液PCR扩增只得到403 bp的β-珠蛋白基因片段,通过电泳证明PCR产物255 bp的片段为SRY基因片段,说明有255 bp扩增带的细胞系为雄性;无255 bp扩增带的细胞系为雌性.结果说明该方法所获得的牛胎儿成纤维细胞可在体外稳定培养,利用PCR鉴定牛胎儿性别具有简单、快速、准确的特点,可应用于基因克隆动物研究中体细胞系的早期性别鉴定.     

利用多重PCR技术快速鉴定牛性别的研究

为了建立一套简单、快速鉴定性别的方法,试验根据牛的Beta基因及SRY基因,设计2对引物(β-1,2和SRY-1,2),对牛96个牛肉DNA样本进行PCR性别鉴定。结果表明:雄性样品扩增出了300 bp和429 bp 2条片段,而雌性样品只能扩增出300 bp 1条片段。40个牛血液DNA样本鉴定结果与实际性别对比,雄性、雌性准确率均为100%。     

籽鹅促卵泡激素β亚基cDNA的分子克隆与序列分析

从新屠宰的雌性籽鹅脑垂体中提取总RNA,经RT-PCR法扩增目的片段,获得长为396 bp的籽鹅促卵泡激素β亚基cDNA片段。将扩增的片段与pMD18-T载体连接,并转化至DH5α感受态细胞中。随机挑选阳性重组子进行鉴定、测序,将测序结果与绵羊、水牛、鸡、鸭等多种哺乳动物和禽类该基因序列及相应氨基酸序列进行同源性分析。结果显示,籽鹅促卵泡激素β亚基基因序列和其它动物一样,都有较高的保守性。其中与鸭的同源性最高,核苷酸同源性为97.0%,氨基酸同源性为100%。总体来看,在各种动物中FSHβ亚基基因同源性是很高的。     

籽鹅促卵泡激素α亚基基因的克隆、序列分析及其原核表达载体的构建

以雌性籽鹅脑垂体的总RNA为模板,利用特异性引物通过RT-PCR扩增获得长为363 bp的籽鹅促卵泡激素α亚基的cDNA片段,将扩增的促卵泡激素α亚基基因片段克隆至pMD18-T载体后进行测序。将测序结果与鸡、鹌鹑、火鸡、鼠、羊、牛等多种禽类和哺乳动物的该基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果表明,这些物种促卵泡激素α亚基基因序列具有较高的保守性,其中与鸡、鹌鹑、火鸡的核苷酸同源性最高,均为95.9%,推导的氨基酸序列与鸡、鹌鹑、火鸡的同源性最高,均为97.5%。为了对克隆的籽鹅促卵泡激素α亚基基因功能研究提供基础,将籽鹅促卵泡激素α亚基基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体。     

牛IRF7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究旨在通过原核表达系统表达牛干扰素调节因子7（interferon regulatory factor 7,IRF7）蛋白,并对其进行纯化,进而制备高纯度的牛IRF7兔多克隆抗体。使用生物信息学软件预测并分析牛IRF7潜在的生物学功能,参考GenBank已公布的牛IRF7基因序列（登录号：NM_001105040.1）设计引物,利用PCR技术从牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）感染的MDBK细胞中扩增牛IRF7基因,连接至pMD19-T克隆载体,提取质粒连接至原核表达载体pET-28a （+）,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建重组质粒pET-28a-IRF7。将重组质粒pET-28a-IRF7转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE进行表达产物的分析与鉴定。通过Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA测定兔抗牛IRF7多克隆抗体效价,经BVDV感染细胞后,实时荧光定量PCR检测抗病毒因子IRF7的表达。生物信息学分析发现,IRF7蛋白不存在跨膜结构域,无信号肽,存在较多磷酸化位点,二级结构主要以无规则卷曲为主,与三级结构的三维模型一致,说明该蛋白可能存在很好的抗原潜力。PCR成功扩增出大小为1 497 bp的IRF7基因片段,成功表达牛IRF7蛋白,分子质量约为60 ku,间接ELISA测得兔抗牛IRF7多克隆抗体效价为1∶128 000,并可与牛IRF7蛋白发生免疫反应,感染BVDV毒株的MDBK细胞中IRF7表达量下降;BVDV感染过表达IRF7后的细胞发现,IRF7能显著促进干扰素-β（IFN-β）的表达（P<0.05）。综上,本研究成功表达纯化了牛IRF7蛋白,并制备兔抗牛IRF7多克隆抗体,为阐明牛IRF7在先天免疫抗病毒应答的分子机制提供了材料。     

牛FSHβ基因真核表达质粒的构建及表达分析

为开发可以体外合成牛促卵泡素(FSH)的表达系统,试验通过基因合成的手段获得牛FSHβ基因的目的片段,并通过酶切及T4 DNA连接酶的作用将FSHβ目的片段构建成pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,并针对构建的pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,采用菌液PCR、双酶切的方法对该重组质粒进行鉴定,并进一步利用293T细胞检测该重组质粒的表达情况。结果表明:菌液PCR和双酶切的结果证实了牛FSHβ基因片段插入了重组质粒中;pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中表达出绿色荧光蛋白,而且经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中转录并翻译出牛FSHβ基因的蛋白表达产物。说明pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组表达质粒构建成功,并且可以在293T细胞中表达。     

口蹄疫病毒牛源整联蛋白受体β3、β8亚基基因的克隆及分子特征分析

本研究旨在从分子角度阐明口蹄疫病毒(FMDV)牛源整联蛋白受体β3和β8基因的结构特征,并为研究病毒遗传变异与宿主范围改变奠定基础。采用RT-PCR技术在国内首次从牛肾组织获得β3和β8基因,并用生物软件对它们的分子特征进行了分析。结果显示:β3亚基基因全长2 355bp,编码784个氨基酸,其中信号肽由22个氨基酸组成,胞外区由692个氨基酸组成,跨膜区由29个氨基酸组成,胞质区由41个氨基酸组成,氨基酸同源性与羊最高,与易感FMDV的牛、骆驼、猪和羊的β3亚基位于同一进化分支,各功能区的保守性为胞质区>跨膜区>配体结合区>胞外区>信号肽,但半胱氨酸富集区的突变率仅次于信号肽。牛源β8亚基基因全长2 304bp,编码767个氨基酸,包括42个氨基酸的信号肽,637个氨基酸的胞外区,29个氨基酸的跨膜区及59个氨基酸的胞质区,氨基酸同源性与马最高,进化分析发现与猪的β8亚基不在同一分支,各功能区的保守性排序为跨膜区>配体结合区>胞质区>胞外区>信号肽。将β3亚基与β8亚基比较发现,β8亚基的配体结合区比β3亚基更为保守,β3亚基的胞质区存在NPLY基序,而β8亚基无此基序,且β8亚基胞质区可变性更高。本研究提示FMDV对ανβ8的利用率高于ανβ3可能与β8亚基配体结合区更为保守有关。     

新疆细毛羊抑制素α亚基cDNA的克隆、序列分析与表达

根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增获得了约812bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET—INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol&#183;L^-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

南江黄羊FSHβ亚基基因内含子1序列的测定及分析

利用GenBank中公布的牛、绵羊等动物FSHβ亚基基因序列设计引物,采用PCR法扩增并测定出南江黄羊FSHβ亚基基因内含子1(in-1)全序列(GenBank登录号为AY838283)。山羊FSHβ基因内含子1全序列长641 bp,A、C、G、T4种碱基分别占35．73%、13．88%、17．47%、32．92%,A T (68．65%)的含量远高于G C(31．35%)的含量。不同物种间FSHβ基因序列相似性的变异范围为24．1%～97．3%,分歧度则为2．6%～85．7%。利用FSHβ亚基基因内含子1序列进行的物种间系统发育分析结果与实际的物种演化顺序一致,表明它可用于物种间的系统发育分析。     

牛抵抗素基因的克隆及原核表达

从健康新生牛大网膜脂肪组织中提取总RNA,根据已发表的牛Resistin mRNA序列设计、合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了343 bp的片段。将该片段克隆于pMD18-T载体后进行序列分析,确认PCR产物为牛Resistin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,回收343 bp的目的片段,定向克隆到pGEX-6P-1表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出牛的Resistin基因的表达。     

20个山羊品种FSHβ基因部分序列测定及与其它8个物种的序列比较分析

利用牛、绵羊等动物FSHβ亚基基因序列设计引物，采用PCR法扩增并测定出20个山羊品种（16个本地品种和4个引进品种）FSHβ亚基基因部分序列（GenBank登录号：AY838283和AY853276）。在测定出的FSHβ亚基基因731bp序列中，包括第1外显子全序列（1～61bp），第1内含子全序列（62～702bp）以及第2外显子部分序列（703-731bp），序列的A＋T含量（66．07％）高于G＋C（33．93％），编码7个氨基酸。在所有测定的序列中共检出3个突变位点，分别是78（-／A）、132（G／A）和343（G／A），这些突变都位于内含子1序列中，它们与产羔率之间的联系需进一步研究。利用山羊以及GenBank中其他8个物种的FSHβ基因内含子1序列进行系统发育分析，部分结果与传统生物分类不一致，可能是由于大部分物种的序列长度不足700bp以及物种之间的关系超过了属阶元的限制。     

猪整合素β3多克隆抗体制备与鉴定

为了制备猪整合素β3多克隆抗体,试验利用大肠杆菌原核表达系统,对密码子优化的猪整合素β3基因主要抗原区进行原核表达,表达的重组蛋白纯化后,免疫Balb/c雌性小鼠,采血后分离血清,进一步通过ELISA和Western-blot对制备的猪整合素β3多克隆抗体进行鉴定。结果表明:猪整合素β3基因主要抗原区获得了成功表达,表达蛋白分子质量为102 ku左右,以纯化重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价为1∶12 800,且能识别天然猪整合素β3。     

荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

抗牛结核分枝杆菌VHH抗体T7噬菌体库的构建与筛选

为获得抗牛结核分枝杆菌的VHH纳米抗体,本研究利用牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白免疫双峰驼,免疫效价达到1∶8 000后采外周血分离淋巴细胞,提取RNA反转录成cDNA,利用巢式PCR方法扩增出编码单域抗体VHH的400 bp基因片段。将目的片段用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,与T7噬菌体载体臂T7Select 10-3RI Arms连接,再通过体外重新包装含目的片段的噬菌体。对建立的VHH噬菌体抗体库进行鉴定,原始文库库容为5.7×10~8 PFU,库阳性率为85.7%。通过4轮生物亲和淘选,筛选并表达出2株高特异性的VHH抗体,均对牛结核分枝杆菌Ag85B蛋白具有特异性。本研究为进一步探讨VHH抗体在牛结核病的诊断和治疗奠定了基础。     

TGF-β1信号通路在副猪嗜血杆菌侵入3D4/21细胞中的作用

本研究旨在探讨猪肺泡巨噬细胞传代细胞系3D4/21中转化生长因子β1(TGF-β1)表达和纤连蛋白(Fn)/α5整合素与副猪嗜血杆菌侵入的关系。通过吸附/侵入试验选择副猪嗜血杆菌最佳吸附/侵入条件;运用荧光定量PCR和ELISA方法检测副猪嗜血杆菌感染细胞后对TGF-β1表达的影响;用TGF-β1预处理3D4/21细胞后,用CFU检测TGF-β1表达对副猪嗜血杆菌侵入的影响;用流式细胞术检测副猪嗜血杆菌感染细胞后Fn/α5整合素表达的变化;用特异的小干扰RNA(siRNA)片段干扰Fn/α5整合素表达水平后,研究其与副猪嗜血杆菌对3D4/21吸附/侵入的影响。结果显示,副猪嗜血杆菌感染细胞后会导致TGF-β1表达增加;用重组TGF-β1预处理3D4/21细胞可以显著提高副猪嗜血杆菌的侵入水平;流式细胞术检测显示,重组TGF-β1和副猪嗜血杆菌分别处理3D4/21细胞可以增加Fn和α5整合素的表达;siRNA干扰3D4/21细胞中Fn和α5整合素的表达,细菌侵入数显著降低;然而,只有当α5整合素被干扰时,副猪嗜血杆菌的吸附数量下降。这些结果表明,TGF-β1和Fn/α5整合素的表达促进了副猪嗜血杆菌对3D4/21细胞的侵入,并在此过程中发挥重要作用。     

PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因进行胚胎性别鉴定的研究

牙釉蛋白（amelogenin,简写为AML）基因是牙齿发育过程中丰富表达的多拷贝基因,AML基因的同源基因分别定位在XY染色体上。本试验利用x—Y同源的牙釉蛋白基因序列设计一对特异性引物（牛AML基因序列的扩增片段长度：雌性为只有467bp的特异性扩增片段：雄性为同时具有341bp和467bp的两条特异性扩增片段）,应用PCR技术同时扩增X和Y染色体上的特异性片段,扩增产物用PAGE电泳分离技术,经硝酸银溶液染色及扫描分析进行妊娠奶牛早期胚胎的性别鉴定。结果显示,从X染色体上扩增出467bp的片段．从Y染色体上扩增出341bp的特异性片段。由此可知,PCR扩增妊娠奶牛牙釉蛋白基因可以进行胚胎的性别鉴定。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

应用巢式POR方法检测牛支原体肺炎

根据Genbank发表的牛支原体全基因序列,设计2对特异性引物,建立了诊断牛支原体肺炎的巢式PCR方法,第一轮引物P1、P2扩增片段长度为1912bp,第二轮引物P3、P4扩增片段长度为422bp：该方法特异性试验未扩增出丝状支原体丝状亚种小克隆和无乳支原体特异性条带;敏感性试验证明扩增DNA最低含量达到10—7Hg／mL,是单一PCR的10^3倍;用该方法对阳性病料进行检测,均扩增出特异性片段。该体系的成功构建,可以为牛支原体肺炎的活体检测,和流行病学调查提供技术支持。