人热休克蛋白10和鼠热休克蛋白10的克隆、序列分析及其原核表达

提取人肝癌SMMC-7721细胞和小鼠NSO细胞总RNA,对热休克蛋白10基因(Hspl0)进行RT-PCR扩增、TA克隆和测序.结果表明,从上述2种细胞中获得的cDNA分别由312,313 bp组成,与报道的人HSPE1 mRNA(NM002157)、鼠肌肉Hspel mRNA(NM-008303)序列同源性分别为9...     

棉花GhRGL基因克隆及其原核表达研究

GA信号转导途径是通过DELLA蛋白来抑止的。通过对Genbank进行Blast比较,我们首次克隆了棉花DELLA蛋白基因,长度为1644bp,分离的棉花DELLA蛋白进行生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥中的DELLA蛋白一样的保守结构域,我们对克隆的基因进行原核表达研究,将克隆的基因转化原核表达载体pET22b,在E.coli BL21（DE3）菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhRGL蛋白, 大小约为64kDa。首次实现了棉花DELLA蛋白基因在原核系统中的表达, 为棉花DELLA蛋白的抗体制备及其表达定位研究奠定了基础。     

梨FWL5基因克隆及表达分析

Fw2.2是调控果实大小的数量性状基因,在果实生长发育过程中扮演重要角色。为探明梨FWL(fruit weight 2.2-like)家族基因在果实发育过程中的作用,本研究以小果型野生杜梨、中果型库尔勒香梨、大果型库尔勒香梨芽变品种‘早美香’以及大果栽培型鸭梨为试验材料,从梨基因组中筛选分离出梨FWL5基因,对该基因进行克隆和序列分析,并利用荧光定量PCR技术检测梨FWL5基因在四个梨品种的果实细胞分裂期表达水平。结果显示,梨FWL5基因开放读码框长度为729 bp,编码了242个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,存在两个跨膜结构。结构域分析发现梨FWL5蛋白包括一个富含半胱氨酸的结构域,属于PLAC8家族基因。系统进化树分析表明,梨FWL5与樱桃Pav CNR12蛋白序列最相近,樱桃PavCNR12蛋白在细胞分裂期能够负调控甜樱桃果实大小,并有可能参与重金属转运。荧光定量PCR检测结果显示,在花期,梨FWL5除在鸭梨盛花期表达量较高,在其余三个梨品种中表达水平相对一致。在幼果期,除‘早美香’外,梨FWL5基因表达水平为杜梨>香梨>鸭梨。本研究结果可为梨FWL5基因在调控果实大小...     

枇杷EjWRKY27基因克隆及低温响应表达分析

WRKY是植物中所特有的转录因子家族,参与植物形态建成及非生物胁迫响应等多种生物学过程。本研究对枇杷EjWRKY27基因进行克隆、生物信息学分析,并对其在枇杷5个发育组织及低温胁迫下的表达模式进行探究。研究结果显示,该基因位于枇杷基因组14号染色体上,编码区长度2 157 bp,编码719个氨基酸,氨基酸序列包含WRKY结构域,属于IIb亚家族成员。系统进化结果进一步显示该序列与同是蔷薇科植物包括苹果、梨、桃、樱桃、梅、杏的同源性较高。生物信息学分析结果表明,EjWRKY27蛋白不是分泌蛋白,也不含信号肽和跨膜区;该蛋白为亲水性蛋白,其分子量、等电点、脂溶指数、不稳定性指数、平均亲水性值依次为73.12 kD,6.90,54.85,56.63,-0.752;EjWRKY27有128个磷酸化位点,其中丝氨酸92个、苏氨酸30个和酪氨酸6个。Ej WRKY27蛋白的二级结构以无规卷曲为主,比例为67.45%,其次为α螺旋,比例为21.5%,而延伸链、β转角的比例仅为8.84%和2.21%。该蛋白的三级结构域主要由RVSVIVR、WRKYGQK、RAYYRC、RKQVQR、ILVTTYE共5...     

沙柳SpsCCD7、SpsCCD8基因克隆及表达分析

类胡萝卜素裂解双加氧酶7 (CCD7)、类胡萝卜素裂解双加氧酶8(CCD8)基因对于植物的侧枝及侧根生长有着重要的影响.本研究以沙柳为研究材料,克隆获得CCD7、CCD8基因序列,进行了生物信息学分析、组织表达特异性及预测分析,为沙柳CCD7、CCD8基因的功能研究及利用奠定基础,丰富了木本植物中CCD基因家族的研究....     

茄子SmWRKY53基因克隆与生物信息学及表达分析

本研究从茄子‘特旺达’幼苗在高温下转录组及基因表达检测数据中,筛选出对高温胁迫响应明显的Sm WRKY53基因,并对其进行克隆和生物信息学及初步表达分析。序列分析显示,Sm WRKY53基因的开放阅读框为1 083 bp,编码360个氨基酸。结构域分析显示,Sm WRKY53第138到144个氨基酸含有一个典型的“WRKYGQK”保守结构域,锌指结构为C₂HC型,属于GroupⅢ亚家族。对其进行同源性比对及系统进化树分析发现,Sm WRKY53与马铃薯(Solanum tuberosum) St WRKY53亲缘关系最近,同源性高达91.41%。生物信息学预测显示,Sm WRKY53为碱性不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜结构域,其蛋白的二级结构元件中无规则卷曲比例最高,达63.89%,且存在氨基酸无序化结构区,亚细胞定位预测该蛋白最可能定位于细胞核内。RT-q PCR分析表明,Sm WRKY53在茄子成熟茎中的相对表达量最高,在果肉中表达量最低。高温胁迫下,茄子幼苗的根、茎和叶中Sm WRKY53表达量先升高后降低,且在3 h达到峰值。本研究为进一步探究SmWRK...     

拟南芥AtTCP4基因克隆及原核表达

为进一步研究转录因子TCP4在植物生长发育过程中的调控作用和下游靶基因。利用生物信息学分析转录因子TCP4家族及其蛋白序列,扩增AtTCP4基因CDS序列、构建原核表达载体并诱导纯化获得蛋白,利用凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证AtTCP4蛋白与拟南芥功能基因LOX2启动子区域的顺式作用元件结合。生物信息学分析表明,拟南芥TCP蛋白含有非典型的螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域;系统进化树表明,AtTCP4属于Ⅱ类TCP蛋白;蛋白三级结构预测表明:转录因子TCP4可以形成同源或异源二聚体。特异性引物扩增获得AtTCP4基因的CDS序列,其开放阅读框(ORF)长为1 263 bp。构建原核表达载体pET-28a-AtTCP4并转化到Rosetta(DE3)感受态中,经IPTG诱导、纯化和Western Blot检测证明获得AtTCP4蛋白。EMSA试验验证AtTCP4蛋白能够结合到功能基因LOX2的顺式作用元件。转录因子TCP4结合功能基因LOX2启动子区域,影响植物激素茉莉酸的生物合成,调控植物的生长发育过程。     

辣椒雄性不育系和保持系CaMADS6基因克隆及表达分析

为探究CaMADS6表达量与辣椒花器官发育之间的关系,以辣椒不育系9704A和保持系9704B为试验材料,克隆CaMADS6进行生物信息学预测,并分析该基因在两系中的时空表达特性。结果表明,从9704A和9704B中克隆得到的CaMADS6编码区序列一致,序列长744 bp,编码247个氨基酸残基。CaMADS6蛋白相对分子量为28.67 ku,理论等电点为8.98,为亲水性蛋白,无跨膜结构,二级结构中α螺旋占57.49%、延伸链占8.91%、无规则卷曲占28.74%。CaMADS6与辣椒CaFUL2同源性100%,蛋白结构域具有典型的MADS-box特征;CaMADS6在两系各发育时期不同器官中均有表达,表达量大小均为花蕾中最高、其次为叶和茎,根中几乎不表达。9704A茎中CaMADS6表达量在苗期、花蕾期和成株期3个发育时期中均显著低于9704B茎中的表达量,叶中CaMADS6表达量在成株期极显著低于9704B叶中表达量。花蕾中CaMADS6表达量在花蕾期和成株期均极显著高于9704B花蕾中表达量,分别为9704B的2.2,3.5倍;CaMADS6在两系植株花器官不同部位均能表达,...     

牡丹PsDXS基因克隆及表达分析

为了探究PsDXS在牡丹萜烯生物合成途径中的作用,本研究以牡丹'皇冠'为材料,采用RT-PCR技术克隆PsDXS基因的cDNA序列,对其序列进行生物信息学分析,并通过qRT-PCR技术分析其在不同花期及器官中的表达模式.结果显示,该基因开放阅读框长度为2 136 bp,编码711个氨基酸;PsDXS蛋白具有Transk...     

方格星虫氨基酸含量测定及其营养价值评定

将鲜方格星虫和干方格星虫用酸水解后使用全自动氨基酸分析仪对氨基酸种类及含量进行测定,并对其营养价值进行评定。结果表明,方格星虫样品中含有18种氨基酸,鲜方格星虫谷氨酸和天门冬氨酸含量较高,分别为3.48%和2.02%,胱氨酸(0.21%)和色氨酸(0.21%)含量较低;干方格星虫中谷氨酸(11.89%)和精氨酸(7.94%)含量较高,胱氨酸(0.45%)和色氨酸(1.07%)含量较低。根据FAO/WHO理想模式评定标准,方格星虫干样品中的氨基酸均达到优质蛋白源标准,鲜方格星虫样品中的氨基酸大部分达到优质蛋白源标准。     

火鹤八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆与其表达分析

旨在为火鹤叶色和花色呈色机理研究提供一定理论依据。以火鹤‘阿拉巴马’为材料,提取火鹤肉穗花序中的总RNA,采用RACE技术克隆得到了八氢番茄红素脱氢酶基因(Aa PDS),通过RT-PCR分析其表达变化。八氢番茄红素脱氢酶基因(Aa PDS)c DNA全长为2226 bp,其中开放阅读框(ORF)共1767个碱基,编码588个氨基酸。序列比对后发现火鹤Aa PDS序列与鹤望兰、水仙、烟草、葡萄、黑藻、向日葵等PDS氨基酸序列存在高度同源性,有74%~79%的一致性。系统进化分析表明火鹤Aa PDS与黑藻、水稻、水仙、鹤望兰等单子叶植物的PDS基因聚类在一起应用。RT-PCR分析表明,Aa PDS在肉穗花序中表达量最高,在佛焰苞中表达次之,在叶、茎、根表达量依次降低。以上结果可见,通过分子生物学进行系统分类与传统植物表观分类学结果一致。类胡萝素代谢途径中的PDS基因在火鹤花器官成色中起一定作用。     

棉花HSP70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

为研究棉花HSP70 基因在转基因植物中抗旱效果,利用前期克隆的GhHSP70 基因,以pCAMBIA1304 质粒为植物表达载体,构建了GhHSP70 基因的植物表达载体CAMBIA1304-HSP70;采用冻融法转入根癌农杆菌EHA105 菌株,通过叶盘法对模式植物烟草进行遗传转化研究。结果表明,在潮霉素(50 mg/L)选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过PCR方法以及GUS基因组织化学法检测鉴定转基因烟草,其中有5 株为阳性植株。初步证实了GhHSP70 基因已导入烟草基因组中。为进一步研究该基因的功能提供实验基础,同时为后续转化棉花改善其抗旱能力奠定基础。     

杨梅肌动蛋白基因MrActin1的克隆及表达分析

扩增杨梅嫩叶中肌动蛋白基因(MrActin1)全长编码区cDNA序列,并评价MrActin1的进化地位,同时分析MrActin1的表达模式。利用RT-PCR扩增MrActin1全长编码区cDNA序列。用生物信息学手段分析预测MrActin1的理化性质和同源性,用临接法构建其的系统发生树。通过Northern blot分析MrActin1在不同组织部位的表达。该基因cDNA序列（GenBank登录号AB 650589）全长1137 bp,编码了1个由377个氨基酸残基组成的蛋白质,所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin氨基酸序列的相似性均在88%以上,根据高等植物Actin相似性构建了进化树,表明MrActin1与陆地棉、圆叶锦葵Actin之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。Northern blot分析表明,MrActin1在杨梅的花、叶、枝条和果组织中恒定表达。首次获得了杨梅MrActin1 cDNA全长序列。     

荸荠查尔酮异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶(CHI)是植物黄酮合成途径的关键酶,为了研究鲜切荸荠贮藏过程中表面黄化的机理,利用RACE技术对荸荠CHI基因编码区cDNA全长进行克隆,并分析其在不同组织和鲜切荸荠贮藏过程中的表达。结果表明,荸荠CHI基因(CwCHI)cDNA序列长度为1 003 bp(GeneBank:MG719238),含有一个744 bp的最大开放阅读框,其DNA包含3个内含子和4个外显子。Cw CHI可编码247个氨基酸,经预测其分子量为26.410 kD,理论等电点为4.89。Cw CHI蛋白的二级结构以α-螺旋为主,占38.06%。通过多重比对发现,CwCHI具有该家族特有的保守结构域,决定底物偏好性的第201位氨基酸为Ser,与其他Ⅰ型CHI蛋白相同。系统进化分析表明CwCHI与油棕榈和菠萝的CHI蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,CwCHI基因在荸荠皮中的表达量最高,而在荸荠肉中的表达最低。鲜切荸荠黄化过程中CHI活性和CwCHI表达量快速上升,水杨酸处理抑制了CHI活性的上升和CwCHI的表达。     

香菇GPX基因克隆及其在采后贮藏中的表达分析

以香菇（Lentinula edodes)为材料,对谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GPX）进行基因的鉴定、编码序列克隆、蛋白生物信息学分析以及基因表达模式分析。结果表明：成功鉴定并克隆1个LeGPX基因,该基因开放阅读框（Open reading frame,ORF） 621 bp,所编码蛋白包含206个氨基酸残基;系统发育分析显示LeGPX蛋白与小皮伞（Marasmius fiardii）和灰色果腐菌（Moniliophthora roreri）的GPX亲缘关系较近,同源比对结果显示LeGPX蛋白包含GPX特征序列和催化位点。生物信息学分析表明：LeGPX为亲水性不稳定蛋白,蛋白分子质量22.81 kD,理论等电点8.83;二级结构以无规则卷曲为主,不含信号肽和跨膜结构。通过原核表达和纯化成功获得了LeGPX可溶性蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）显示蛋白大小符合预期。荧光定量PCR分析表明,香菇褐变发生过程中LeGPX基因表达量快速上升,并且与菌盖相比,LeGPX在香菇菌柄部位表达更为活跃。     

川西獐牙菜SmGES基因的克隆、生物信息学分析与原核表达

研究藏药川西獐牙菜中环烯醚萜合成途径中的关键酶香叶醇合成酶的功能,并探讨其在香叶醇、龙胆苦苷和獐牙菜苦苷生物合成中的作用。以川西獐牙菜叶片为材料,提取RNA并反转为cDNA,通过川西獐牙菜转录组相关信息,用RT-PCR技术克隆得到了川西獐牙菜香叶醇合成酶基因,并命名为SmGES基因。将SmGES基因片段通过分子生物学的方法连接到原核表达载体pET-28a上并转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)原核表达感受态中,进行相关的诱导表达。通过生物信息学进行相关分析得出,SmGES基因长1761 bp,编码586个氨基酸;SmGES蛋白等电点为5.35,相对分子质量为67.78 kDa。分析表明SmGES基因带有叶绿体转运肽,预测其是定位于叶绿体的亲水蛋白。文章还分析了该蛋白的细胞内定位、结构域、二级和三级结构。进化关系分析表明,SmGES基因与滇龙胆的GES基因具有较近的亲缘关系。诱导得到重组蛋白分子质量67.78 kDa的蛋白条带,与预期大小一致。研究结果为进一步阐明川西獐牙菜中环烯醚萜合成途径提供参考。     

烟草细胞质小分子热激蛋白基因Nt- Hsp17.8的克隆及胁迫诱导表达特性分析

越来越多的研究表明,非生物胁迫影响植物的生长发育与栽培范围.为了通过转基因方法提高栽培番茄、马铃薯对热和干旱组合胁迫的抗性,利用RT-PCR结合RACE技术,从热处理的烟草叶片中分离出了细胞质小分子热激蛋白基因.分析表明,该基因cDNA全长876 bp,包含一个480 bp的开放阅读框,编码159个氨基酸,相对分子量约...     

水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析

通过生物信息学及RT-qPCR(quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)的方法对水稻OsUCH-L5基因进行探究.生物信息学预测结果表明,该基因全长837 bp,编码278个氨基酸;OsUCH-L 5蛋白的相对分子质量为31.64 kDa,等电点为5.66,为亲水性蛋白,具备Peptida...     

番茄褪绿病毒CP基因克隆、序列分析及原核表达

为制备番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,To CV)抗血清,以番茄病叶为试验材料,提取总RNA,根据To CV CP基因设计特异性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,构建原核表达载体p ET32a-To CVCP,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达CP蛋白。结果表明:To CV CP基因(Gen Bank登录号:KT809400)全长774 bp,编码257个氨基酸,与Gen Bank中其他地区分离物核苷酸序列同源性为97.2%~99.6%,推导的氨基酸序列同源性为97.3%~100.0%。核苷酸序列保守位点占全部位点的91.3%,氨基酸序列保守位点占全部位点的88.3%,表明不同地理来源的番茄褪绿病毒的CP基因保守性较高。将To CV CP基因克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,并在体外条件下诱导表达出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,转p ET32a-To CVCP载体的大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株表达了分子量约33 k Da的重组蛋白。该重组蛋白在37℃,1.0 mmol/L IPTG、诱导6 h,表达量最大。