LAMP检测无乳链球菌方法的建立及应用

以无乳链球菌纤连蛋白fbs基因为主要研究对象,采取环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对fbs基因的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在63℃保温1 h,通过荧光显色即可完成对无乳链球菌的检测工作.结果显示,LAMP方法能够特异性检测fbs基因,其检测灵敏度是常规PCR方法的100倍,并与实时荧光定量PCR方法相当.所建立的针对无乳链球菌fbs基因的LAMP检测方法具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,非常适合无乳链球菌的快速检测.     

基于qPCR和LAMP技术的马铃薯晚疫病菌快速检测方法

马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）能侵染多种茄科植物,它引起的马铃薯晚疫病,是马铃薯生产中的第一大病害。为了开发能在田间快速检测马铃薯晚疫病病原的方法,利用P. infestans T30-4基因组测序数据的contig 1.18131,设计qPCR和LAMP引物,优化扩增条件后得到引物的特异性和灵敏度,最后通过检测田间收获薯块,比较形态学传统方法、qPCR及LAMP的差异。特异性检测结果发现,qPCR和LAMP仅在含有P. infestans DNA模板的体系有阳性扩增,在寄主和其他微生物DNA中均无扩增;在优化的条件下,qPCR和LAMP的检测下限可达1×10 ^-6ng/μL,在有寄主和其他微生物DNA存在的条件下,引物的灵敏度没有显著差异。利用两种快速方法对在大理、丽江及昆明3个地区田间收获薯块上检测发现,qPCR和LAMP方法得到的检出率差异极为不显著（P=0.420）,两种快速检测方法和形态学鉴定方法检出率差异极显著（P=0.009）。在大理、丽江及昆明3个地区的薯块中,两种分子检测方法检出率均比形态学方法高。其中,qPCR检测方法比形态学方法分别提高了12.00%、2.00%、8.70%;LAMP检测方法比形态学方法分别提高了11.30%、2.00%、8.70%。     

转基因玉米LAMP检测体系的建立及应用

以转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11为研究材料,建立Bt11环状等温扩增快速检测技术方法.利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,针对Bt11中玉米基因组与外源基因结合处序列,设计4条特异引物,并对反应温度、时间、灵敏度、结果判断方法等参数进行初步探索.结果显示,LAMP检测方法最适反应温度及反应时间分别为65℃和60 min,其灵敏度为常规定性PCR的20倍.LAMP技术检测转基因玉米品系Bt11具有特异性高、快速、简便等优点,具有广阔的应用前景.     

玉米根腐病菌麦根腐平脐蠕孢的LAMP检测方法

麦根腐平脐蠕孢是玉米根腐病的重要病原菌之一,旨为建立一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)的麦根腐平脐蠕孢快速检测方法。首先,根据麦根腐平脐蠕孢参与黑色素生物合成途径的Brn1基因部分序列设计了一套LAMP检测引物;然后,针对该引物组筛选了其最佳反应温度,检测了LAMP反应的特异性和灵敏度,并以人工接种麦根腐平脐蠕孢的玉米根腐病病株为样本评价了LAMP检测方法的效果。结果表明,本研究设计的引物组在61～68℃条件下均能实现对靶标基因的扩增,其中以66℃为最佳反应温度;在特异性检测中,引物组能从10种分离自玉米根腐病样本的主要病原真菌DNA中特异性地检测出麦根腐平脐蠕孢;在灵敏度检测中,对携带靶基因Brn1的质粒DNA最低检测限是10 copies/μL,在此检测限浓度下,25 min左右即可实现扩增;在对玉米根腐病样本检测中,在1 pg/μL的玉米根组织DNA中即可检测出麦根腐平脐蠕孢。建立的麦根腐平脐蠕孢LAMP检测方法具有较强的特异性和较高的灵敏度。     

环介导等温扩增技术检测含有CaMV35S的转基因玉米

DNA环介导等温扩增技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术.针对玉米表达载体的花椰菜花叶病毒35 S启动子(CaMV35S)的6个区域设计4种特异引物,对LAMP反应的MgSO4、dNTPs、Betaine、内引物、外引物各个成分进行了优化,此外还对LAMP和PCR两种不同方法的特异性进行了比较.建立转基因玉米花...     

核酸环介导等温扩增技术及其在植物检疫中的应用

介绍核酸环介导等温扩增技术的基本原理、特点及应用前景.环介导等温扩增技术具有简单、快速、特异性强和扩增效率高等特点,目前可部分替代普通PCR,日后伴随着不断改进、完善和标准化,必将在植物检疫上有广阔的应用前景.     

甜瓜种子中黄瓜花叶病毒和小西葫芦黄花叶病毒的RT-LAMP可视化检测方法

本研究旨在针对甜瓜种子中携带的黄瓜花叶病毒(CMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),建立可视化环介导等温扩增检测方法。根据CMV和ZYMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列,分别设计并筛选出2套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,通过对反应体系中主要影响因素的优化,建立适用于快速检测CMV和ZYMV的RT-LAMP检测方法。对优化后的2种LAMP检测方法进行特异性和灵敏度验证。结果表明,建立的2种LAMP检测方法分别能够特异性地检测出CMV和ZYMV,检测灵敏度较常规RT-PCR分别高出10倍和100倍,并且可通过肉眼观察直接对反应结果进行判定。该方法的建立为基层及现场快速检测甜瓜种子的带毒情况提供了新方法。     

草酰胺对菇渣混合基质理化性状和番茄幼苗生长的影响

为提高工厂化育苗生产效率,降低生产成本,方便管理者取得简单易用的肥料,试验以菇渣有机复合基质为育苗基质,以缓效氮肥草酰胺为肥源,番茄为试验材料,采用穴盘育苗法研究了草酰胺在培育番茄壮苗中的施肥效果。结果表明,与施速效肥尿素基质EC值相比,在整个育苗过程中,施缓效肥草酰胺的育苗基质EC值变化平缓,呈现缓慢上升而后缓慢下降的趋势;草酰胺施肥处理能够促进番茄幼苗对N、P、K营养元素的均衡吸收,利于鲜重、干重的快速积累,幼苗生长较快,株高、茎粗和叶绿素含量显著高于尿素处理,幼苗生长健壮。表明草酰胺是培育壮苗的优良氮肥肥源,能够促进番茄壮苗形成,操作简单,适于工厂化育苗使用。     

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因的检测

为了检测黑龙江省稻瘟病菌无毒基因ACE1、AVR-Pi9、AVR-Pia、AVR-Pii和AVR1-CO39的存在情况,采用5对无毒基因引物,对2017年黑龙江省208个稻瘟病菌单孢菌株DNA进行PCR扩增检测。结果表明,ACE1出现频率最高（87.98％）;AVR1-CO39出现频率最低（0）;无毒基因AVR-Pi9的出现频率为79.81％;AVR-Pia的出现频率为16.35％;AVR-Pii的出现频率为0.48％。黑龙江省稻瘟病菌无毒基因群体组成结构错综复杂,且具有明显的地域特点。     

环介导恒温扩增技术（LAMP）及其在植物病毒检测中的研究进展

环介导恒温扩增技术是一种特异、灵敏、简单的新型核酸扩增技术,目前,该技术已经被广泛应用于疾病诊断、食品安全检测及基因芯片等领域。本研究简要介绍了该技术的原理、操作技术及特点,归纳了近些年来该技术在植物病毒（DNA病毒、RNA病毒）、类病毒检测中的应用,并指出了其在应用中呈现的问题及解决办法,最后展望了该技术在植物病害综合防控中的应用前景。     

基于PCR的两步法丝状真菌基因敲除方法

基因敲除是研究真菌基因功能的重要方法之一,目前,丝状真菌敲除多采用基因两侧的同源臂对基因组的靶标进行同源替换,然后采用抗生素对转化子进行筛选,但这存在着筛选效率低、假阳性率高、操作复杂等问题。本研究以稻瘟菌为研究对象,采取以下步骤对此进行优化:1)构建HPH-GFP(潮霉素-绿色荧光蛋白)融合表达载体; 2)分别用带有接头序列的引物克隆待敲除基因上、下游片段; 3)克隆上、下游片段与HPH-GFP组成嵌合体片段; 4)嵌合体片段转化真菌原生质体; 5)对敲除突变体进行筛选。结果表明,该法操作简便、高效,除了用潮霉素HPH作为筛选标记外,还可用GFP作为荧光筛选标记,极大提高了筛选效率,可用作丝状真菌基因功能研究。     

N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用

烟草的N基因是一个较为有效的抗烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)基因,在抗病育种中发挥着重要的作用。为建立其标记基因PCR检测体系,评估已知目的基因cDNA序列作为分子标记的目的基因辅助育种的可行性,本文依据N基因cDNA序列设计4对扩增范围在150～950bp的不同片段长度引物,并对含有N基因的coker176基因组DNA进行PCR扩增。扩增结果表明,有3对可扩增出特异产物。测序结果表明,有2对引物的扩增产物含有内含子。根据所获得的DNA序列设计出2对用于分子标记辅助育种的引物,并分别对C151、NC89、coker176等11个品种的基因组DNA进行扩增,结果表明在coker176、龙江912、吉烟9号和龙江911品种中有扩增产物,除龙江911外,这一结果与已知的N基因在11个品种的分布相一致,成功建立了N基因PCR检测体系,并证明以cDNA序列设计引物扩增DNA序列的目的基因辅助育种技术完全可行。并对实验中出现的问题进行了研究。     

自然环境下单木检测方法研究——基于改进Faster-RCNN网络

为研究在果林智能产业化过程中的单木检测技术,实现果林的精准管理,采集江西省赣南地区脐橙果园的高空间分辨率遥感数据,通过K-means聚类分析anchor(锚点)改进网络参数;提出一种改进的网络结构Des Faster-RCNN网络,保证在网络卷积提取特征的过程中,对浅层特征的复用以及融合;在训练过程中加入了迁移学习进行...     

基于气相色谱的1-MCP检测方法及释放规律研究

以异丁烯作为标准物,绘制标准曲线,采用气相色谱法对1-MCP浓度进行测定.建立条件如下:柱温100℃,载气压力120 kPa,进样器温度130℃,检测器温度150℃,进样量2 mL.此检测条件下,异丁烯和1-MCP浓度与峰面积值均呈良好线性关系,可用于精确检测1-MCP气体的浓度.商品1-MCP释放条件为用水浸湿(或高湿度),释放速率与浸湿程度相关,干燥条件下不释放1-MCP气体.低温(0℃)条件对1-MCP气体的释放产生抑制作用,释放速率显著低于常温(28℃)条件.用保鲜袋包装青皮核桃并进行1-MCP处理(1-MCP药包放置于保鲜袋上部封口处)发现,相同时间内靠近药包放置点的1-MCP积累浓度显著高于远离药包放置点的位置,表现为上部>中部>下部,且10 h内差异均达显著水平.     

基于软X-射线造影和机器智能的玉米种子活力检测方法研究

为了提高玉米单产,在播种之前对种子活力进行检测十分必要。提出一种将传统的软X-射线检测方法与计算机智能识别相结合的新方法。首先建立corn_pixel结构,然后通过确定种子尖端位置和形心建立种胚区域的椭圆不等式对种胚区域进行标识。以椭圆短半轴b及种胚区域渗钡像素比率M1/M和非种胚区域渗钡像素比率K1/K为输入特征,以标准发芽试验结果为输出,建立BP神经网络单粒种子活力识别模型。结果表明,当b=2CD/5时,识别的准确率最高,以该b值为依据进行分组试验的平均准确率可达95%以上。     

基于质构和感官评价方法构建绿葡萄干干燥标准及快速检测技术

绿葡萄干较高的经济价值是维持新疆葡萄产业优势地位的重要支撑,葡萄干含水率对葡萄干的色泽、营养品质、质构特性和感官品尝体验具有较大的影响,但相关研究较少。本研究通过对不同含水率绿葡萄干品质、质构特性和感官品尝结果进行关联性分析,将定量检测技术应用到葡萄干的生产中。结果表明,不同含水率葡萄干的营养品质具有一定的差异,色泽分析中绿色色泽的差异最为显著;11.9%~19.2%含水率区间内葡萄干的质构特性呈现出较好的线性上升或下降趋势;不同人群对不同含水率葡萄干的感官品尝结果具有较大差异,含水率高的葡萄干在不同年龄段人群中的感官评分较高,根据感官评价结果和葡萄干的贮藏特性综合评价,生产中葡萄干含水率应控制在14%~17%;对葡萄干含水率与质构指标进行拟合,预测值与实测值的相对误差较小,弹性的相对误差最小为2.91%,粘附性的相对误差最大为13.33%;含水率14%~17%的葡萄干硬度预测值分别为1349.86、1191.75、1033.64、875.53 g;以硬度为快速检测指标,快速计算葡萄干含水率、弹性、咀嚼性等指标,拟合度较高,硬度与含水率的拟合方程为y=(-0.00006x+0.2191)×100,R²值为0.9171。综上,不同含水率葡萄干的色泽品质具有较大的差异,不同人群均喜欢较高含水率的葡萄干,采用硬度值快速计算葡萄干含水率及其他质构特性指标具有一定的可行性。研究结果可为绿葡萄干的标准化生产提供数据支撑和理论依据。