己烯雌酚人工抗原的合成和酶免疫检测方法的建立

通过化学方法合成己烯雌酚单羧甲基醚，并通过核磁共振和质谱进行鉴定；分别用混合酸酐法和碳二亚胺法将其与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联，合成己烯雌酚人工抗原，经紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳和动物免疫试验证实人工抗原合成成功，并制备了抗己烯雌酚的特异性多克隆抗体，同时建立了己烯雌酚的酶免疫检测方法，这对动物性食品中己烯雌酚的残留检测有重要意义。     

卡那霉素人工抗原的制备及鉴定

为了人工制备卡那霉素完全抗原。将卡那霉素标准品与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联,制备人工抗原。利用两种不同的偶联方法：碳二亚胺法(EDC)和戊二醛法(GDA),分别制备出KAN-BSA（作为免疫原）,KAN-GDA-OVA（作为包被原）。利用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定和动物免疫试验等,鉴定了完全抗原偶联情况。结果显示：制备的卡那霉素完全抗原能刺激小鼠机体产生相应抗体,且抗血清效价均达到1:2.56×10⁴,其中一号小鼠的IC₅₀值为22.28 ng/mL,说明完全抗原免疫原性良好,抗原制备成功。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

叶酸人工抗原合成及免疫抗血清的鉴定

叶酸是人体必需的营养物质,叶酸的缺乏可以引起神经管畸形等多种疾病,建立叶酸的快速检测方法对营养强化食品的质控以及临床研究具有重要意义。本实验通过活化酯法合成叶酸-牛血清白蛋白（FA-BSA）人工免疫原,通过混合酸酐法制备叶酸-卵清蛋白（OVA）包被原。通过紫外扫描和免疫动物进行人工抗原的合成鉴定。根据BSA、OVA的含量以及人工抗原、BSA、OVA及叶酸（FA）的紫外吸收曲线在280nm处的摩尔吸收值,计算出叶酸与BSA的偶联比为1：3.84, 叶酸与OVA的偶联比为4.70。利用合成的叶酸人工抗原免疫小鼠,三免后眼眶内眦静脉采血,采用间接ELISA方法测定免疫小鼠多抗血清效价在128,000以上,叶酸对抗血清的IC50为14.82ng/ml;由此表明叶酸人工免疫原合成成功,为进一步研究叶酸单克隆抗体奠定基础。     

伊维菌素人工抗原的制备及鉴定

为制备伊维菌素人工完全抗原,通过对伊维菌素进行化学修饰,引入活性基团羧基,合成具有半抗原结构特征的伊维菌素半琥珀酸酯。然后采用NHS法将半抗原与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工免疫原IVM-BSA和检测原IVM-OVA,经SDS-PAGE和紫外光谱扫描鉴定。用人工免疫原IVM-BSA免疫Balb/c小鼠,间接竞争ELISA法测定抗血清效价。结果发现：偶联物IVM-BSA和IVM-OVA的偶联比分别为14.1:1和14.7:1,免疫小鼠抗血清效价达到1:12800,结果说明成功制备出人工完全抗原并且具有良好的免疫原性。     

黄曲霉毒素B1完全抗原合成及鼠源多抗血清的制备

为了合成黄曲霉毒素B1(AFB1)完全抗原,制备鼠源AFB1多克隆抗体血清。通过琥珀酰亚胺酯法在黄曲霉毒素B1(AFB1)分子上引入羧基,生成黄曲霉毒素B1肟(AFB1O)。用EDC法和DCC法合成AFB1-BSA和AFB1-OVA。采用薄层层析技术、紫外光谱技术(Uv)、SDS-PAGE鉴定完全抗原的合成。通过免疫BALB/c小鼠,获得鼠原多克隆血清,采用间接ELISA方法测定多抗血清的免疫效价,用竞争ELISA检测多克隆血清的敏感性和特异性。结果表明：免疫小鼠血清效价都在1:3200以上,其中6号鼠效价最高,到达1.28×10-4,敏感性好,半数抑制浓度IC50为22.268 ng/mL,交叉反应率低。本研究成功制备了AFB1完全抗原,获得了敏感的AFB1多克隆抗体血清,为以后制备AFB1单克隆抗体及免疫学快速检测方法奠定了基础。     

氰戊菊酯特异性人工抗原的合成与鉴定

基于农药小分子人工抗原设计合成的基本原则,以氰戊菊酯的特征菊酸部分——氰戊菊酸作为半抗原,与载体蛋白BSA偶联合成了氰戊菊酯免疫特异性人工结合抗原,并对抗原合成条件进行了探索。结果表明,抗原合成反应温度以室温为宜,偶联时缓冲液的最佳pH值为8.0;通过紫外分光光度仪扫描,合成抗原的紫外图谱相对于半抗原和载体蛋白均发生了偏移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳结果表明,合成产物蛋白条带明显在载体蛋白条带之后,即合成产物的分子量大于相应的载体蛋白分子量,从而判定偶联是成功的。     

环丙沙星单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

用EDC法将BSA和OVA分别和环丙沙星（Ciprofloxacin, CIP）偶联作为免疫原和包被原,并经紫外扫描 (UV Scan)、聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定。用合成的BSA-CIP免疫BALB/c小鼠,经过3次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌CIP单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备CIP mAb,对CIP mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明BSA-CIP人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-4;其中2号小鼠血清CIP抑制效价较高且IC50最低,达48.59μg/L,融合后筛选出Z3G12B3和Z2H8C10两株敏感特异的杂交瘤细胞,其两株细胞培养上清液效价为1:512,腹水效价为1:2.56×105,Z3G12B3株对CIP的IC50为2.47μg/L,与二氟沙星、沙拉沙星有小于0.03％的交叉反应性,与其他抑制物无交叉反应性。本试验获得了高效价、敏感、特异的抗CIP mAb,为CIP残留ELISA检测试剂盒和试纸条的建立奠定了坚实的基础。     

西马特罗人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

拟合成并鉴定西马特罗(Cimaterol,CIM)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源CIM多克隆抗血清.通过重氮化方法将西马特罗偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-CIM和包被抗原OVA-CIM,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行了鉴定.结果表明,半抗原CIM和载体蛋白偶联成功.动物免疫试验结果显示,6只小鼠效价均达1×10-3以上,且4号小鼠多抗血清抗CIM的IC50为86.9 ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力高的的鼠源抗CIM多抗血清.     

特布他林人工抗原的合成及鼠源多克隆抗血清的制备

合成并鉴定特布他林（Terbutaline,TBL）人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源TBL多克隆抗血清。分别通过1,4丁二醚法和EDC法将特布他林偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原BSA-TBL和包被抗原OVA-TBL,并采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果表明半抗原TBL分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;受免6只小鼠效价均达1×10-4以上,且1号小鼠多抗血清抗TBL的IC50为55.88 ng/mL。本试验成功合成了TBL人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗血清,为TBL单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

氯霉素多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定

将氯霉素（CAP）进行化学修饰引入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯（CAP-HS）;采用混合酸酐（MA）法将CAP-HS与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫原BSA-CAP-HS和包被原OVA-CAP-HS,用红外（IR）、紫外（UV）、凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定;用BSA-CAP-HS免疫新西兰白兔和SPF鸡制备多克隆抗体（pAb）,间接ELISA测定其效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,琼脂双扩散试验、WestGold膜杂交试验和交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,BSA-CAP-HS偶联成功,其分子结合比为15.6∶1,获得了高价、敏感、特异的CAP pAb,为CAP残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

溴氰菊酯人工抗原合成及鉴定

以二溴菊酸和3-[(4-硝基苯)氧基]苯甲醛为原料经4步反应合成了溴氰菊酯半抗原1-氰基[3-(4-氨基苯)苯基]甲基-2,2-二甲基3-(2,2-二溴乙烯基)环丙烷羧酸酯;用重氮化法将溴氰菊酯半抗原分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）相偶联制备免疫抗原和包被抗原,紫外吸收法估算偶联比分别为11:1和8:1;以BSA偶联物作免疫抗原免疫日本大耳白兔制备溴氰菊酯多克隆抗体,间接非竞争ELISA法测定2个抗血清效价分别为100000和80000,间接竞争ELISA法初步测定农药浓度50μg/ml时抑制率达到80%以上,为研究建立溴氰菊酯农残免疫快速测定方法奠定了基础。     

二氟沙星单克隆抗体的研制及其免疫学特性的鉴定

采用改进的碳二亚胺法,将半抗原二氟沙星(DIF)与载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,,制备得到二氟沙星全抗原DIF-BSA和DIF-OVA。采用紫外（UV）,凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定; 用BSA-DIF免疫 BALB/C小鼠, 间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备二氟沙星单克隆抗体（DIFmAb）,并对其效价、亲和力和特异性等进行鉴定。结果表明,BSA与DIF偶联成功,分子结合比为1：4.7,筛选出1H10、2F12、4D8共3株敏感特异的杂交瘤细胞, 间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:5.12×102、1：3.2×101、1：2.56×102,腹水效价分别为1：2.56×105、1：1.28×105、1：6.4×104。同种亚型分别为IgG1、IgG1、IgG2a,亲和常数（Ka）分别为2.94×1010 L/moL、1.72×1010 L/moL和1.35×1010 L/moL.亲和力最高的1H10对DIF的IC50为1.64ng/ml,单抗与其他氟喹诺酮类药物和磺胺类药物无交叉反应。通过试验获得高效价、敏感、特异的mAb,适用于动物性食品中DIF的残留检测的免疫学试验     

对位红抗原合成和多克隆抗体的制备

制备了一种特异性强的抗对位红的多克隆抗体。采用混合酸酐法将活化的对位红半抗原与阳离子化牛血清白蛋白（cBSA）偶联成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体,利用紫外分光光度计分析结合物的结合情况,间接ELISA和间接竞争ELISA分析抗体特性。紫外扫描分析的免疫原对位红与蛋白结合的偶联率为14:1,间接竞争ELISA法分析多克隆抗体效价达到1×106,50%抑制率检测限为7.43 ng/mL,检测的对位红线性范围在0.1 ng/mL～1μg/mL,抗体与对位红和苏丹红I交叉反应率分别为100%和97.8%,与苏丹红II、III、IV和甲苯胺红的交叉反应率很低,与罗丹明类色素无交叉反应。制备的对位红多克隆抗体具有很高的特异性,与其他色素交叉反应率低,可用于对位红在食品中残留的检测。