枇杷EjNAC82的克隆及其对类胡萝卜素合成基因EjPSY、EjBCH的转录激活分析

为了探讨NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素代谢的调控机制,以大红袍(红肉枇杷)和白沙(白肉枇杷)为试验材料,利用RNA-Seq技术对大红袍和白沙进行转录组测序,通过分析两个品种间的转录组差异,初步筛选并克隆出了1个枇杷NAC转录因子,命名为EjNAC82。生物信息学技术分析结果发现,EjNAC82具有NAC转录因子特有的结构域、理化性质和蛋白质结构特点,是典型的NAC转录因子家族基因。亚细胞定位试验发现该转录因子定位于细胞核。实时荧光定量PCR结果表明,EjNAC82在枇杷老叶中的表达量高于根、芽、嫩叶、老叶、嫩枝、老枝、幼果和熟果。EjNAC82在果皮和果肉成熟过程中的表达模式相同,均呈先上升后下降再上升的趋势。随着果实的成熟,EjNAC82在大红袍果肉中的表达显著高于白沙(P<0.05)。EjNAC82在大红袍果皮S1、S2、S4时期的表达显著高于白沙。LUC/REN双荧光素酶试验结果表明,EjNAC82对EjPSY1、EjPSY2和EjBCH启动子具有激活作用。这些结果表明EjNAC82可能通过调控EjPSY1、EjPSY2和EjBCH基因的表达从而正向调控枇杷果实中类胡萝卜素的合成。本研究结果为揭示NAC转录因子对枇杷果实类胡萝卜素积累的转录调控功能提供了理论依据。     

甘蔗R2R3-MYB类似基因Sc2RMyb1的克隆及表达特性分析

R2R3-MYB是MYB转录因子基因家族的主要成员,已被证明在次生代谢和非生物逆境胁迫应答中起重要作用。为获得甘蔗(Saccharum complex)R2R3-MYB转录因子基因序列信息及其在不同非生物因子胁迫下的表达情况,本研究通过对甘蔗EST数据的分析,运用电子克隆获得一个甘蔗R2R3-MYB类似基因序列,进而采用PCR方法从甘蔗中克隆了该基因的基因组DNA和cDNA序列,基因命名为Sc2RMyb1(GenBank序列号:JQ823165)。Sc2RMyb1的基因组DNA全长1807bp,由3个外显子和2个内含子构成,编码区长度为1284bp,编码427个氨基酸。构建含有Sc2RMyb1基因的原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichia coli),经IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52kD。在NaCl胁迫的LB培养基上,重组菌生长明显优于对照菌。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗中Sc2RMyb1基因的表达受H2O2和NaCl抑制而下调,推测该基因作为负调节因子参与了NaCl胁迫应答相关基因的调控过程。本研究结果为后续该类转录因子基因在甘蔗抗逆相关机理研究和抗逆育种中的应用提供了基础资料。     

月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组...     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

葡萄VvERF90的克隆及对乙烯合成基因的调控研究

ERF转录因子为植物特有的一类转录因子,在调控植物乙烯合成过程中发挥着重要功能。为研究葡萄ERF转录因子在调控乙烯合成过程中的作用,以阳光玫瑰(Vitis labruscana Baily × V. vinifera L.)葡萄穗梗为材料,克隆了乙烯响应因子VvERF90,并进行了生物信息学分析和基因功能分析。结果表明,VvERF90属于第IX亚家族,与苹果MdERF2和MdERF3的亲缘关系较近;VvERF90可以正调控VvACO1的表达;VvERF90在拟南芥中过量表达后,转基因植株中VvACO1的同源基因AtACO3基因表达量明显升高,转基因植株的乙烯释放量增加2倍,植株变矮。上述结果表明,VvERF90可能通过调节VvACO1的表达,调控乙烯的释放水平。本研究结果为进一步探明葡萄中乙烯合成的调控机制奠定了理论基础。     

百香果低温胁迫转录组及茉莉酸代谢基因分析

为研究百香果低温胁迫响应机制,以紫果百香果(Passiflora edulia Sims)为试验材料在0℃下低温胁迫处理,以常温处理为对照组(CK),采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序,并对茉莉酸代谢相关基因进行挖掘.结果显示,共获得百香果转录组数据45.30 Gb,组装得到39 521条Unige...     

猪背膘组织二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT1和DGAT2)的发育性表达分析

酰基辅酶A:二脂酰甘油酰基转移酶(acyl-coA:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是催化甘油三酯合成最后一步反应的关键酶,包括DGAT1和DGAT2两种;阐明其在发育过程中的表达规律对于找到控制中外猪种脂肪沉积能力差异的基因十分必要.本研究分别用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR的方法分别对莱芜猪和杜洛克3日龄仔猪和成年猪背膘组织中DGAT1和DGAT2 mRNA表达量进行了分析.结果表明,莱芜猪和杜洛克成年猪DGAT1 mRNA的表达量均高于3日龄仔猪,分别为5.0倍和2.7倍;成年猪DGAT2 mRNA表达量高于3日龄仔猪,分别为27.6倍(P＜0.01)和4.8倍(P＜0.05).两品种成年猪和3日龄仔猪DGAT2基因表达量的变化均高于DGAT1.品种间同一发育时期比较,杜洛克3日龄仔猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于莱芜猪,但成年莱芜猪背膘组织中DGAT2基因的表达量高于杜洛克,差异均不显著(P＞0.05).提示DGAT2基因可能与中外猪品种脂肪沉积能力的差异有关.     

黑番鸭血管活性肠肽受体-1基因(VIPR-1)的cDNA克隆及其组织表达特性分析

最近的研究表明,血管活性肠肽(VIP)与家禽的就巢习性密切相关。本研究采用反转录PCR方法从黒番鸭(Cairina moschata)母鸭下丘脑组织中克隆了血管活性肠肽受体(VIPR-1)基因的cDNA序列,长度为1125bp,编码355个氨基酸(GenBank登录号:JN625215)。序列比对结果表明,该序列与家禽(鸡、火鸡、鹌鹑)和哺乳动物(人、小鼠、猪、牛)的基因序列分别有93%~94%和69%~71%的同源性,而相应氨基酸序列的同源性分别为96%和70%~72%。荧光定量PCR结果发现,黒番鸭VIPR-1基因的表达量在产蛋期、就巢期和休产期差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),就巢期表达量最高,休产期次之,产蛋期表达量最低,表明VIPR-1基因与繁殖阶段变化密切相关;对不同组织VIPR-1的表达量分析发现,VIPR-1在垂体、下丘脑和卵巢中均有表达,其中垂体最多,其次是下丘脑,卵巢中的表达量最低,差异极显著(P<0.01)。研究结果提示,VIPR-1基因具有高度保守性,参与下丘脑-垂体-卵巢轴(特别是垂体)对黑番鸭就巢行为的调控。     

胡萝卜DcDREB-A6亚族转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

干旱响应元件结合蛋白(dehydration responsive element-binding protein,DREB)类转录因子是干旱应答元件的结合蛋白,在植物响应非生物胁迫时发挥重要作用。本研究基于胡萝卜(Daucus carota L.)转录组数据,检索和拼接获得一个胡萝卜DREB类转录因子基因序列,并根据其序列设计引物,采用RTPCR方法从黑田五寸获得该胡萝卜转录因子基因DcDREB-A6(GenBank登录号:KM386646)。序列分析显示,来源于胡萝卜中的DcDREB-A6基因含有993 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸。氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性和三级结构分析结果显示,胡萝卜DcDREB-A6转录因子蛋白质分子量为36.68 kD,等电点为6.00,属于亲水性蛋白。进化树分析显示,DcDREB-A6属于APETLA 2/乙烯反应元件结合蛋白(AP2/ERF)家族转录因子中DREB亚族中的A6组。空间结构表明,该转录因子结构域具有典型的植物AP2/ERF家族转录因子的结构特征,有1个α螺旋和3个β折叠。实时定量荧光PCR证实,胡萝卜DcDREB-A6转录因子基因受高温、低温和高盐胁迫诱导,分别在高温、低温处理4和2 h后表达量增加2倍左右;盐胁迫对其影响较大,处理8 h时,基因表达量增加4.6倍;而干旱胁迫下该基因表达变化幅度相对较小。胡萝卜DcDREB-A6转录因子基因能够响应高温、低温、干旱和高盐等非生物胁迫,本研究结果有助于进一步开展胡萝卜DREB类转录因子的逆境调控研究。     

桃PpNAC19的克隆及其对PpCCD4启动子活性的调节分析

为探究桃NAC基因对类胡萝卜素积累的调控作用,本研究从桃中克隆得到PpNAC19基因.序列分析表明,PpNAC19(XP_007223324.1)开放阅读框为867 bp,编码288个氨基酸,预测蛋白质分子量为33.2 kDa,平均疏水系数为-0.719,属于亲水性蛋白,含有一个典型的NAM结构域.亚细胞定位预测PpN...     

大黄鱼microRNA荧光定量PCR中内参基因的选择与评价

为筛选适用于大黄鱼miRNA研究的内参基因,选取饥饿试验组(EG)中饥饿21d及正常投喂组(CG,对照)的大黄鱼肌肉组织进行miRNA高通量测序,初步筛选得到稳定表达的6个miRNA:miR-23a-3p,miR-4508,miR-1961,miR-1297,miR-1956-3p和Let-7。采用实时荧光定量PCR法检测这6个miRNA和3个传统的内参基因(U6,5S和18S)在大黄鱼6种组织(肌肉、肝脏、肾、脾、脑和心脏)以及不同饥饿时间段的肌肉组织中的表达,并利用Ge Norm,Best Keeper以及Norm Finder对数据进行分析。结果表明,miRNA的表达稳定性优于传统内参基因。在CG组大黄鱼不同组织中,最稳定单内参基因是miR-23a-3p,最佳内参基因组合为miR-23a-3p和Let-7。在不同饥饿时间的EG组大黄鱼肌肉组织中,最稳定单内参基因是miR-23a-3p,最佳内参基因组合为Let-7和miR-1961。本试验结果为研究大黄鱼miRNA时内参基因的选择提供了参考。     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

小麦3个NAC转录因子基因克隆与功能分析

NAC类转录因子参与植物基因在不同条件、不同发育期的表达调控,在植物的发育、生长及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫应答中起关键的调控作用。本研究对非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29＊6/Yr5的cDNA文库进行筛选及同源克隆,获得了小麦3个NAC类转录因子的cDNA序列。序列分析结果表明,这3个转录因子都具有DNA结合结构域,即NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的A、B、C、D和E5个亚区高度保守;同时发现这3个NAC类转录因子都有核定位信号及相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,发现其中之一的TaNAC1属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,TaNAC3属于ATAF1亚组,TaNAC5属于NAM亚组;根据系统进化树和相关基因的功能分析,我们推测小麦转录因子TaNAC1、TaNAC3和TaNAC5可能参与植物生长发育调控或对生物、非生物胁迫作出的应答反应。     

桃MPK3基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究MPK3响应GA信号调控休眠解除的分子机理,以中油四号油桃为试验材料,通过实时荧光定量PCR发现GA诱导下MAPKs家族基因在桃芽中有不同程度的表达,其中PpMPK3响应GA正调控表现最强烈。利用MEGA6.0、MEME、GSDS、DNAMAN 6.0等软件对桃PpMPK3基因进行生物信息学分析,结果表明,PpMPK3的cDNA全长1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白分子量约为42.6 kD,理论等电点为5.62,属于亲水性不稳定蛋白。预测PpMPK3蛋白发生磷酸化修饰的位点有45个,不存在糖基化位点。PpMPK3蛋白的二级结构中α-螺旋占41.35%,延伸链占10.54%,无规则卷曲为48.11%。进化树分析表明,PpMPK3氨基酸序列与甜樱桃亲缘关系最近,同源性为99.73%。通过亚细胞定位发现,PpMPK3定位于细胞核。RT-PCR结果表明,PpMPK3的表达模式与休眠解除过程相一致,推测PpMPK3能够响应GA信号,促进休眠解除。本研究结果为桃设施栽培的休眠调控提供了一定的理论依据。     

高羊茅硝态氮转运蛋白基因NRT1.1的克隆及表达模式分析

为探究高羊茅(Festuca arundinacea)硝态氮转运蛋白基因(NRT1.1)的表达模式,本研究以黔草1号高羊茅为试验材料,采用RACE和RT-qPCR技术对高羊茅NRT1.1基因的cDNA全长序列进行扩增,并对其不同胁迫处理下的表达情况进行分析。生物信息学分析发现,高羊茅NRT1.1的理论等电点为4.81,平均亲小性为0.919,含有约32.63%α-螺旋、7.63%β-转角和53.73%不规则卷曲。结果表明,NRT1.1基因的cDNA序列全长为2 328 bp,编码606个氨基酸,预测蛋白质分子量为193.9 kDa,且高羊茅NRT1.1与黑麦草NRT1.1氨基酸序列的相似性最高。RT-qPCR表达分析发现,高羊茅叶片NRT1.1受低氮处理0.5～1 h时表达量达到峰值,显著(P<0.05)高于对照组;在干旱和热处理下,NRT1.1表达量分别在6 h和12 h时达到峰值,且显著(P<0.05)高于对照组;在盐处理下,仅在6 h时NRT1.1表达量高于对照组,其余时间均受显著(P<0.05)抑制。本研究结果为解析高羊茅NRT1.1基因的表达模式提供了分子生...     

西南鸢尾花色变异实时定量PCR内参基因的筛选与验证

为筛选适用于不同花色西南鸢尾花色合成途径相关基因表达分析的内参基因,本研究根据西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾花蕾组织的转录组测序数据,筛选了6个常用内参基因(ɑ-TUB、β-TUB、AQP、ACT、GAPDH、UBQ),同时以百合18S做为对照内参基因,在西南鸢尾及其白花变型白花西南鸢尾的花蕾组织中,分别通过反转录PCR(RT-PCR)初筛和RT-qPCR检测表达量,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件对7个候选内参基因的稳定性进行评价。RT-PCR初筛结果显示,7个候选内参基因引物的特异性均较好,在6个样品间没有明显差异;RT-qPCR分析表明,7个候选内参基因的表达量存在一定差异,其中18S表达量最高,UBQ最低;geNorm、NormFinder和BestKeeper分析结果表明,ACT表现最稳定,最适合做为内参基因,β-TUB相对稳定性最低;以Actin为内参对西南鸢尾类黄酮/花青素和类胡萝卜素2类色素合成途径中部分相关基因的RT-qPCR分析结果与转录组测序结果相一致。本研究为鸢尾属植物花色素合成相关基因表达分析内参基因的筛选以及鸢尾属植物资源利用和花色育种研究提供了理论参考。