一株拮抗水稻白叶枯病菌的淡紫灰链霉菌的筛选鉴定及其生防效果研究

 为发现绿色安全的水稻白叶枯病天然生物防治微生物,本研究从植物根际土壤中分离获得165株放线菌。利用共培养法和牛津杯法,筛选获得了5株拮抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的放线菌,其中拮抗能力最强的是Sl-10菌株,发酵液抑菌圈直径为62.1 mm ± 1.5 mm。根据形态特征、生理生化实验、16S rDNA序列和系统发育分析,鉴定Sl-10菌株为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。Sl-10菌株发酵液对大豆斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. glycinea)、烟草野火病菌(P. syringae pv. tabaci)、油菜黑腐病菌(X. campestris pv. campestris)、大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)、水稻条斑病菌(X. oryzae pv. oryzicola)、烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)和番茄叶斑病菌(P. syringae pv. tomato)7种植物病原细菌均有拮抗作用。Sl-10菌株发酵液具有较好的耐光、耐酸碱和热稳定性。SDS-PAGE电泳结果显示,Sl-10菌株可抑制Xoo的蛋白质合成。4个品种水稻(甬优15、湘两优900、嘉丰2号和甬优1540)喷施Sl-10菌株发酵液,水稻白叶枯病的病斑抑制率达到82.27%~91.78%。研究结果显示,淡紫灰链霉菌Sl-10菌株具有较好的水稻白叶枯病生物防治潜能。     

高寒草甸根围拮抗芽孢杆菌筛选鉴定及脂肽化合物分析

本研究通过平板对峙法分别从青海日月山及达日地区高寒草甸根围分离菌株中筛选到8株对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum及水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae均具有明显拮抗效果的芽孢杆菌菌株RYS41、RYS42、RYS43、RYS44、DR1、DR2、DR3及DR20。生理生化、脂肪酸甲脂、16S rDNA及gyrB基因测序等分析结果表明,菌株RYS41、RYS42、RYS43、RYS44为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens;菌株DR1、DR2、DR3、DR20鉴定为短小芽孢杆菌B.pumilus。MALDI-TOF-MS质谱分析结果表明,菌株RYS41产生脂肽类化合物Surfactin、Bacillomycins D和Fengycin,菌株DR20产生脂肽类化合物Surfactin、IturinA和Fengycin,推断可能与对油菜菌核菌及水稻白叶枯病菌的拮抗作用有关。     

水稻白叶枯病菌室内链霉素抗性菌株的诱导及其抗性分子机制和风险评价

通过紫外光照射诱导获得了6株水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae抗链霉素突变体。测得链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(MIC)分别为0.10和600 μg/mL;对敏感菌株的有效抑制中浓度(EC50)为0.03 μg/mL,对抗性菌株的平均EC50值为11.64 μg/mL,平均抗性倍数为388。通过PCR扩增了敏感菌株ZJ173及5株抗性菌株的rpsL基因(编码S12核糖体蛋白)和rrs基因(编码16S rRNA),并检测了strA基因是否存在。序列分析表明,5株被测抗性菌株的rpsL基因均发生了突变,其中4株在氨基酸43位、1株在88位,均由赖氨酸突变为精氨酸,而rrs基因未发生突变,strA基因未被检测到。表明实验室诱导获得的水稻白叶枯病菌抗性菌株对链霉素的抗药性是由rpsL基因突变引起的。抗性风险研究表明,抗性突变体的抗药性在无药剂压力下可稳定保持,其致病性、生长速率与敏感菌株相比无明显差异,竞争性低于或略低于敏感菌株,抗性自发突变率较高,且抗性突变为单一位点突变,病害循环为多循环,因此由rpsL基因突变引起的水稻白叶枯病菌对链霉素的抗性风险较高。     

棉花枯萎病拮抗放线菌K5的分离与鉴定

从扬州地区土壤中分离到207株放线菌,以棉花枯萎病菌为目标菌,采用抑菌带法测定,筛选到9株有拮抗活性菌株,占所分离总数的4.3%.其中K5对棉花枯萎病菌的拮抗作用最强,抑茜带宽为8mm,同时对其它病菌也有一定的拮抗作用.盆栽试验结果表明菌株K5对棉花枯萎病防治效果达46.5%,与多菌灵相当.通过对菌株K5的形态观察、培养特征、生理生化反应和16S rDNA测定,将其鉴定为玫瑰产色链霉菌Streptomyces roseochromogenus.     

2007年防城港市晚稻白叶枯病调查及其病原细菌的分离与鉴定

采集防城港市防城区各乡镇水稻病叶,分离、得到29个黄色单菌落,应用剪叶接种法回接水稻日本晴、9311和特优63三个品种,有11个菌株能在该3个水稻品种上发病,其它黄色单菌落在这些水稻上均不发病.在电子显微镜下观察,这11个病原菌均为单细胞,短杆状,两端钝圆,革兰氏染色阴性.再将从回接发病的稻叶中分离到的黄色单菌落的细胞在电子显微镜下观察,其形态特征与回接前的菌株完全一致.通过对菌株的16S rRNA基因序列比对分析,发现与Xanthomonas oryzae pv.oryzae PXO99A的序列一致性为99%,证实获得的11个分离菌株为水稻白叶枯病菌.     

冻土荒漠区分离低温适生PGPR菌的鉴定及其抗菌促生特性

对分离自青海昆仑山口冻土荒漠区植被根围的7株可在4及10℃低温条件下正常生长的低温适生菌进行鉴定分析,并检测其拮抗病原菌活性及催芽促生特性。综合理化测定、BOX-PCR 及 ERIC-PCR 指纹图谱分析、16S rDNA及基因gyrB序列鉴定结果,其中6株菌株为简单芽孢杆菌Bacillus simplex,1株菌株为B. malacitensis。平板对峙试验表明,7株菌株对油菜菌核病原菌Sclerotinia sclerotiorum及水稻白叶枯病原菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 具有显著拮抗效果。以菌株 KLD2（B. simplex）及 KLD5（B. malacitensis）发酵菌液处理玉米种子及拟南芥幼苗,结果表明菌株发酵液可明显促进种子萌发及幼苗生长,其鲜重、根长、须根数等表征均有显著增加。几株低温适生PGPR（plant growth promoting rhizobacteria）芽孢杆菌具备抗菌、催芽及促生特性,具有农业应用潜力。     

水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测

 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)是水稻种子产地检疫中最重要的两种检疫对象,且同属于水稻黄单胞杆菌。本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原的全基因组序列比对分析,得到一系列能够区分两种病原的特异性PCR引物。结合简单的PCR技术及全自动DNA分析系统,我们选取了12对引物分别对23株水稻白叶枯病菌和5株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证。结果获得了2对显性标记(Xoo-Hpa1和Xoc-ORF2)以及3对共显性分子标记(M568、M897和M1575)可以达到理想的区分检测两种病原的效果。分子标记的检测灵敏度从5×10⁴到5 × 10⁷cfu·mL^-1不等,且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌。本研究丰富了检测标记的靶位点,并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析,增强了检测的可靠性,有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用。     

香蕉枯萎病拮抗内生菌的分离、筛选及盆栽防效试验

采用组织表面消毒法分离变叶木、益智、阴香、槟榔、椰子和菠萝蜜6种植物的内生菌,获得91株内生菌,其中内生细菌45株,内生真菌38株,内生放线菌8株。以香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)为靶标菌,对分离的内生菌株进行皿内拮抗活性筛选,发现内生真菌、内生放线菌抑菌效果不理想,内生细菌YXG2-3拮抗效果最好,抑菌带达20mm,其次是BYG2-5、BYJ5-1、YXJ2-2。对4株内生细菌进行盆栽试验,发现菌株YXG2-3防效最好,达到63.8%,与其他处理达极显著水平。     

利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌

 设计水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,并建立相应的PCR检测体系,分别对31株水稻细菌性条斑病菌和15株水稻白叶枯病菌及其它相关菌株进行了测试。结果表明,建立的PCR检测体系可专化性检测水稻细菌性条斑病菌,而水稻白叶枯病菌和其它菌株均没有扩增信号。检测灵敏度可以达到20个细菌菌体,从自然发病和人工接种发病的水稻种子成功地检测出条斑病菌。实现了对水稻细菌性条斑病菌的快速和专化性检测。     

纳木错盐湖中度嗜盐放线菌区系研究

为探明纳木错盐湖中度嗜盐放线菌的数量、种类组成、拮抗活性和酶活性。采用盐浓度为5%和10%的4种分离培养基,利用稀释平板倾注法对盐湖土壤和水样放线菌进行分离,通过形态特征、培养特征和细胞壁化学组成对放线菌进行初步鉴定,并对分离到的放线菌进行抑菌和酶活性试验。结果表明：从纳木错盐湖土壤和水样中分离到36株中等嗜盐放线菌,其中土样中26株,水样中10株。分别属于链霉菌属（Streptomyces）、诺卡氏菌属（Nocardia）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）和红球菌属（Rhodococcus）。放线菌形态学排重后合并为13株,抑菌活性实验结果表明,分别有4株放线菌对小麦赤霉菌、小麦根腐病菌和烟草赤星病菌有抑菌活性,抑菌率占30.8%。其中对小麦根腐病菌的抑制活性最强,最大抑菌圈直径达22 mm。酶活性测定发现,纳木错盐湖中度嗜盐放线菌的酶活性菌株数少且弱。     

OsHsp18.0-CI调控水稻对白叶枯病的抗性

 热激蛋白广泛存在于各种生物中,响应多种生物胁迫和非生物胁迫。前期研究结果显示,在水稻中超量表达小热激蛋白OsHsp18.0-CI基因,能通过增强水稻的基础防卫反应提高对水稻细菌性条斑病的抗性。本研究发现,OsHsp18.0-CI基因也能够受到白叶枯病菌的诱导表达,超量表达OsHsp18.0-CI的转基因水稻也增强了对多个白叶枯病致病菌株的抗性。转录组测序分析发现,OsHsp18.0-CI基因介导的水稻对白叶枯病的抗病信号途径有部分类似于其介导的对细菌性条斑病的抗性路径,同时也有大量新的未知功能基因的参与。以上结果表明,OsHsp18.0-CI基因受到病原菌的侵染时,也能通过增强水稻的基础防卫反应来提高对白叶枯病的抗性。     

水稻白叶枯病菌Zur和HrpG平行调控hrcC基因表达

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。     

水稻白叶枯病菌Zur和HrpG平行调控hrcC基因表达

 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS)由hrp基因簇编码,其决定在寄主水稻上的致病性。hrcC是hrp基因簇中hrpA转录单元仅有的一个基因,推测编码T3SS的核心组分蛋白。在Xoo中,hrcC在致病性中的功能以及受调控的机制仍未明确。本研究构建了hrcC的缺失突变体及其功能互补子,发现hrcC缺失使Xoo丧失了在寄主水稻上的致病性以及在非寄主烟草上激发过敏反应(Hypersensitive response, HR)的能力,功能互补子能够恢复这些表型至野生型水平。启动子GUS活性的定量测定和蛋白免疫杂交试验,证明hrcC的转录表达依赖于主要的hrp调控子HrpG,而不受HrpX调控;HrpG和铁转运家族类调控子(Ferric uptake regulator family)Zur以平行独立的方式正调控hrcC基因的转录表达。异源功能互补、启动子活性和蛋白表达试验发现Xoo和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)的hrcC基因在致病性上的功能具有互置性,以及受HrpG、HrpX和Zur的调控模式也具有相似性。这些研究为进一步解析黄单胞菌的hrp调控网络与全毒性调控网络之间的交叉提供了新的线索。     

7种检疫性植物病原黄单胞菌III型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

 γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。     

磷酸甘油转移酶基因在水稻白叶枯病菌致病力中的作用研究

稻黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白叶枯病,是水稻上的重要致灾病害之一。前期基因组学分析发现,Xoo菌株PXO99^A的PXO＿04062基因可能编码一个磷酸甘油转移酶,推测与病原菌的致病力有关。本研究采用自杀质粒pK18mobsacB介导的方法,构建了该基因的缺失突变体,并对突变体进行了反式互补。水稻上致病性测定发现,与野生型菌株相比,PXO＿04062基因的缺失突变体DM04062在寄主水稻日本晴上的致病力显著下降,并且其胞外多糖产量、运动性、生物膜形成等均明显降低。进一步采用RNA-seq方法比较突变体转录组的变化,发现突变体中的差异表达基因共有533个,其中包括多个致病相关基因,如胞外多糖合成和细胞运动性等相关基因。与野生型相比,这些基因在突变体中的表达均显著下调。这些结果说明,白叶枯病菌的磷酸甘油转移酶基因是通过影响多种致病力相关因子的合成,来影响病菌在水稻上的致病力。     

水稻白叶枯病菌毒性基因调控hrp基因表达的分析

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)侵染寄主水稻,引起水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)。病原菌主要依赖hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)将效应蛋白(T3SS effectors,T3SEs)注入水稻细胞中,激发水稻的抗(感)病性。同源性搜索结果显示,植物病原黄单胞菌中已鉴定的一些毒性基因在Xoo的代表菌株PXO99A中保守存在。为了明确这些毒性基因对hrp基因表达调控的影响,本研究利用pK18mob-W介导的定点突变方法,成功获得了14个毒性基因的突变体;在突变体中,利用hrp∶∶gusA融合表达体系,通过GUS活性定量测定检测了hrpG、hrpX和hrpB1的启动子活性;通过荧光定量PCR技术,检测了这3个基因的mRNA水平。结果显示,双组分调控系统ColR/ColS、RpfC/RpfG和转录调控子Clp负调控hrpG和hrpB1的表达;Trh和Xrv A通过HrpG-HrpX途径正调控hrpB1的表达;HpaR1和Fur不依赖于HrpG仅通过HrpX正调控hrpB1的表达。这些调控关系的鉴定为解析水稻黄单胞菌hrp调控网络提供了新的线索。     

十字花科黑腐病菌IV型分泌系统的诱导表达与抗逆功能分析

 细菌通过IV型分泌系统(Type IV Secretion System, T4SS)的接合系统、效应物转运系统和释放/吸收系统3个子家族进行DNA、蛋白质及毒素的分泌和转运。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是一种重要的植物病原菌,也是研究植物病原细菌与植物相互作用机理的模式细菌之一。本研究通过检测Xcc 8004野生型菌株和T4SS突变体在不同条件下的生长、诱导情况及对过敏反应的影响发现:T4SS不影响在培养基中的生长,与野生型菌株相比,T4SS突变体在非寄主辣椒ECW-10R上的过敏反应减弱;T4SS相关基因受基本培养基MMX诱导表达,且与Ni²⁺、H₂O₂、Phenol等抗逆相关。推测T4SS相关基因在该病原菌的接触、识别阶段起作用。     

进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测

 利用MT选择性培养基从加拿大进境油菜籽样品中分离到2株细菌分离物2305-1和5309-1,对分离物进行致病性测定、LOPAT测试、Biolog测试、hrpZ和cfl基因序列分析,以及多位点序列分析。结果表明:2株分离物人工接种油菜、花椰菜和番茄幼苗都能引起典型黑斑症状;LOPAT测试和Biolog测试结果与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的各项生理指标一致;hrpZ基因序列与十字花科黑斑病菌(P. syringae pv. maculicola)和番茄细菌性叶斑病菌(P. syringae pv.tomato)的序列相似性均为99.18%～100%;cfl基因序列分析表明分离物2305-1和5309-1基因组中存在冠毒素合成基因;选择gyrB、ropD、gltA、 gap1、 acnB和pgi 6个看家基因进行多位点序列分析,系统发育树显示分离物2305-1和5309-1均与P. syringae pv. ma-culicola聚在一起。根据试验结果将分离物2305-1和5309-1鉴定为十字花科黑斑病菌P. syringae pv. maculicola。