致病疫霉拮抗细菌SR13-2菌株的鉴定及对马铃薯离体组织的防病作用

SR13-2菌株是前期从种植莴苣的土壤中分离获得的对致病疫霉菌丝生长和孢子萌发有强烈抑制作用的拮抗细菌,为进一步了解其生物学特性以及防治马铃薯晚疫病的潜力,本试验依据其培养特征、生理生化特性及16S r DNA序列对该菌株进行了鉴定,并测试了其菌液在离体马铃薯组织上的防病效果。结果显示该菌株属于深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea),菌液在马铃薯块茎切片上对晚疫病的预防效果可达91.83%,治疗效果可达83.33%,显著优于甲霜灵锰锌以及其他几株拮抗细菌,在马铃薯离体叶片上也获得了相似的结果。这表明SR13-2菌株在马铃薯晚疫病防治方面有较大潜力。     

三株拮抗菌对导致马铃薯晚疫病的致病疫霉的抑制作用比较

为了明确前期获得的对致病疫霉有显著抑制和诱抗作用的拮抗菌中生防潜力更大的菌株,以对峙培养法、打孔法、离体组织切片法对菌株Sy11、M15和A5295抑制致病疫霉的部分性能和抑菌效果进行了比较。结果显示,在抑制致病疫霉菌丝生长和孢子萌发方面,Sy11和M15均显著优于A5295,在马铃薯块茎切片上预防晚疫病方面,三者之间无显著差异;但Sy11在抑制致病疫霉孢子囊形成和游动孢子萌发方面则明显优于M15;Sy11的抑制率分别为68.9%和71.3%,M15的抑制率分别为56.7%和67.3%,两者之间有显著差异。表明Sy11菌株对马铃薯晚疫病的防治具有更大的应用潜力。     

中国东北地区马铃薯致病疫霉遗传多样性分析

为明确东北地区马铃薯致病疫霉在DNA分子水平上的遗传差异,利用SSR分子标记技术对2016年采自黑龙江、吉林、辽宁的117株致病疫霉的基因型进行鉴定和命名,并对其进行遗传多样性分析。结果显示,在SSR位点Pi4B和Pi4G上共检测到 10个等位基因,其中等位基因161和206出现频率最高,占明显优势。鉴定出的14个SSR基因型分别为A-03、A-10、B-01、D-03、E-01、F-01、F-02、F-06、G-02、G-03、G-07、K-01、L-01、N-01,其中A-10和N-01为这些地区之前未见报道的新基因型;F-06为主导基因型,占29.0%。经聚类分析,在遗传相似度为0.85时14种SSR基因型可划分为10个类群,表明菌株聚类与其地理来源无相关性。最后通过POPGENE1.32软件对3个省份的致病疫霉群体遗传多样性进行分析,结果显示它们之间的遗传差异较小,黑龙江省与吉林省的遗传距离最小,仅为0.0213。这些结果表明东北地区马铃薯致病疫霉的SSR基因型组成类群较多、且遗传多样性丰富。     

重庆地区致病疫霉交配型测定

通过对峙培养在RSA和RTA上对重庆地区主要马铃薯和番茄产区的致病疫霉交配型进行了测定。结果显示,分离自重庆地区8个县(区)的186个致病疫霉菌株均为A1交配型,没有检测到A2交配型。这一结果表明该地区的致病疫霉仍以A1交配型为主。     

重庆地区致病疫霉(Phytophthora infestans)交配型测定

通过对峙培养在RSA和RTA上对重庆地区主要马铃薯和番茄产区的致病疫霉交配型进行了测定。结果显示，分离自重庆地区8个县（区）的186个致病疫霉菌株均为A1交配型，没有检测到A2交配型。这一结果表明该地区的致病疫霉仍以A1交配型为主。     

致病疫霉(Phytophthora infestans)的分离与培养方法

针对不同地区的病样，分别采用直接分离法、保湿培养分离法、薯片夹叶分离法、薯片诱导分离法等分离方法，利用选择性培养基SRA进行分离，通过挑取菌落边缘菌丝尖端于斜面培养基进行纯化，共获得重庆马铃薯和番茄主产区186个致病疫霉菌株。测定代表性菌株在不同培养基上的菌落生长和产孢量。结果表明，致病疫霉在RSA上生长最快，RA和RSB次之；在RSB上产孢最多，RTA次之。     

两种配方快速分离纯化马铃薯致病疫霉菌株效果的比较

为了能在田间快速分离马铃薯致病疫霉菌株,同时能将实验室内被污染的致病疫霉菌株有效地纯化出来,对在黑麦培养基中添加制霉菌素配方和红药水配方分离致病疫霉菌株的效果进行了比较。结果显示,从田间马铃薯病叶上直接分离致病疫霉菌株时,制霉菌素配方的纯化率高于红药水配方,分别为74%和52%;在分离实验室受杂菌污染的致病疫霉菌株时,红药水配方的纯化率高于制霉菌素配方,分别为78%和36%;两种配方对致病疫霉菌株后期生长均有一定的抑制作用,其中制霉菌素配方的抑制作用明显强于红药水配方,两者的生长抑制率分别为65.79％和18.63％;然而,两种配方对致病疫霉菌株后期产生孢子囊的数量、孢子囊直接萌发和游动孢子释放、致病疫霉菌丝体的可溶性蛋白含量都没有显著影响,同时在3个感病马铃薯品种上的致病性也均没有明显影响。田间病叶上采集的致病疫霉菌株在制霉菌素配方的黑麦培养基冻存管中20℃最长可保存16个月,表明制霉菌素配方更适合于田间快速分离纯化致病疫霉菌株,而红药水配方更适合于分离纯化实验室内被污染的致病疫霉菌株。     

拮抗放线菌Sy11菌株感应的致病疫霉信号分子初步研究

为明确拮抗放线菌Sy11菌株在预防马铃薯晚疫病方面的潜力,以及Sy11菌株与致病疫霉间的感应现象,采用打孔法和离体组织培养等方法检测Sy11菌株对致病疫霉的抑制和离体生防效果,通过对峙培养法和纸板隔离法明确菌株间的感应现象以及由Sy11菌株感应的致病疫霉信号分子的溶解性和稳定性。结果表明,Sy11菌株活体和菌液对致病疫霉菌丝体生长的抑制率分别为89.7%和82.5%,菌液在马铃薯离体块茎和叶片上的相对保护率均高于85.0%;此外Sy11菌株只有在致病疫霉的诱导作用下才分泌抑菌物质,诱导后产生并分泌的抑菌物质的抑菌率达76.5%;Sy11菌株感应的致病疫霉信号分子易溶于甲醇,可耐受80℃高温。以上结果表明Sy11菌株在预防马铃薯晚疫病方面有较大潜力。本研究为今后进一步分离纯化致病疫霉信号分子,明确感应诱导作用机理提供参考依据。     

致病疫霉木瓜蛋白酶亚家族基因C1A-PH-SCH1的克隆与表达分析

为进一步明确引起马铃薯晚疫病的致病因子,通过克隆马铃薯晚疫病致病疫霉菌分泌蛋白中的半胱氨酸蛋白酶家族基因,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达。本试验采用TA克隆法,提取来自云南马铃薯产区的致病疫霉菌XH05-5-4的总RNA,反转录cDNA,PCR扩增后将该基因片段连接到载体,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。克隆获得半胱氨酸蛋白酶家族基因全长为1176 bp,包含1个最大的开放阅读框1077 bp,编码387个氨基酸。推测蛋白相对分子量41.671 kD,理论等电点4.88;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的蛋白与预期蛋白相符合。生物活性测定表明：马铃薯叶片出现坏死,类似于晚疫病症状。利用TA克隆技术从致病疫霉菌XH05-5-4中克隆得到了1个半胱氨酸蛋白酶家族基因（登录号：KP938956命名：C1A-PH-SCH1）,通过同源性比对发现C1A-PH-SCH1为木瓜蛋白酶亚家族基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了表达,对生物活性测定结果显示出现了类似于晚疫病症状的水渍坏死斑症状,推测C1A-PH-SCH1参与马铃薯晚疫病的发病过程。     

Resistance to Phytophthora infestans in Potato Genotypes Originating from Wild Species

The reaction to P. infestans in the foliage and tubers of potato was evaluated in resistant genotypes and in their progeny. The genotypes originated from wild species known to carry genes for specific resistance. Evidence was obtained that three types of resistance to P. infestans were presented in the genotypes: (1) Resistance due to major, dominant genes was predominant. The presence of these genes was expressed in both foliage and tubers and did not influence maturity. Some of the genes were R genes, providing specific resistance, but for others this could not be determined as they were effective against the fungus inoculum with the highest virulence available: 1.2.3.4.5.7.10.11. (2) Resistance was present, associated with late maturity. (3) Tuber resistance was present, expressed after inoculation of whole tubers but not after inoculation of tuber slices. Testing of the progeny was essential for the determination of the type of resistance present in the genotypes evaluated.     

地衣芽孢杆菌对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

为了明确地衣芽孢杆菌对马铃薯晚疫病菌的抑制作用,研究了地衣芽孢杆菌对马铃薯晚疫病菌菌丝生长、游动孢子释放、游动孢子萌发、孢子囊萌发产生芽管的抑制作用.结果表明:地衣芽孢杆菌对马铃薯晚疫病菌的菌丝生长、游动孢子释放和游动孢子萌发有明显的抑制作用,对菌丝生长的抑制作用,抑菌带平均宽度达到5.58 mm,在稀释度为101时地衣芽孢杆菌对游动孢子释放的抑制率高达86.11%,对游动孢子萌发的抑制率也达到了78.1%.但地衣芽孢杆菌对马铃薯晚疫病菌的孢子囊萌发产生芽管抑制作用较弱.     

Potato Tuber Resistance to Phytophthora infestans and its Relation to Maturity

Tuber resistance to P. infestans was evaluated in the progeny of potato genotypes differing in levels of resistance and maturity. Two methods of tuber evaluation were used: testing whole tubers and testing tuber slices. In the progeny, some genotypes were superior in resistance to the more resistant parent. This superiority was never associated with early maturity. The results of both tuber-testing methods were positively correlated but the interaction genotypes X years was more pronounced in the reaction of tuber slices. It is concluded that: (1) transgression in tuber resistance may be obtained, (2) a high level of tuber resistance is difficult to combine with early maturity and (3) the expression of genes for specific resistance was more pronounced in testing tuber slices than in testing whole tubers.     

The reaction of potato differentials to Phytophthora infestans isolates collected in nature

Available data have been evaluated on the reaction of potato differentials to over 5000 Phytophthora infestans isolates, collected in various parts of the world. The differentials were able to identify up to 11 virulence factors in P. infestans. The isolates differed in virulence expression, depending on the isolate and testing conditions. All 11 virulence factors were found in both ‘old’ and ‘new’P. infestans populations. The resistance of individual differentials was not overcome with equal frequency. The resistance of differentials R5, R8 and R9 was overcome least frequently. This may be due to instability of expression of the respective virulence factors in P. infestans and/or the kind of resistance present in the differentials. Whatever the reason, such resistance may possibly be used in breeding potato cultivars with durable resistance to P. infestans.     

中国东北部与河北省致病疫霉SSR基因型的组成与分析

为了解中国东北部致病疫霉基因型分布及变化规律。利用2对SSR引物Pi4B和Pi4G对2008-2010年期间采自于河北、黑龙江、辽宁和吉林的373株致病疫霉的SSR基因型进行分析,4个省份共鉴定出16种SSR基因型,分别为A-03、A-09、B-01、D-03、F-01、F-04、F-05、F-06、F-07、F-08、G-02、G-03、I-01、J-01、K-01和L-01,其中主导基因型为F-01,占所测菌株的67.83%,其次为F-06基因型(14.75%);河北、黑龙江、辽宁和吉林4个省份SSR基因型的种类分别为11种、8种、4种和3种;16种基因型中,A-09、F-07、F-08、I-01、J-01、K-01和L-01等7种基因型在东北及河北地区属首次报道;2008-2010年期间,河北省和黑龙江省致病疫霉SSR基因型数量均有所增加,辽宁和吉林基因型种类变化不明显,但总体上东北地区和河北省致病疫霉优势基因型较单一,这为上述地区制定马铃薯晚疫病综合防治策略、尤其是品种的合理布局提供了一定的理论依据。     

20种植物提取物对马铃薯晚疫病菌的抗菌活性研究

在室内测试了20种植物提取物对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用,结果表明9种植物提取物对孢子囊萌发具有显著的抑制作用,6种植物提取物对孢子囊产生具有显著的抑制作用。其中Ts-86、Ts-39、Ts-109和Ts-121四种提取物抑菌效果与化学药剂“Ridomil”3000倍达到同一显著水平,并对其进行了进一步测试。结果表明,Ts-86对马铃薯晚疫病菌产孢及孢子囊萌发的抑制效果显著优于另外3种提取物,与“Ridomil”3000倍达到同一显著水平。