高粱抗病基因SbSGT1的克隆及原核表达

为探究高粱抗病基因SbSGT1的功能,以高粱BTx623为材料,利用RNA反转录得cDNA,以cDNA为模板扩增出全长SbSGT1基因,并对其进行生物信息学分析。进一步构建pET-28a-SbSGT1重组质粒进行原核表达,并分别对表达菌株、诱导温度以及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导浓度进行了优化。结果表明,SbSGT1全长1 095 bp,编码364个氨基酸,蛋白理论分子大小约为40.45 kDa,蛋白质等电点为5.0。进化树分析表明,SbSGT1与玉米和水稻的亲缘性较高;蛋白质序列分析表明,SbSGT1蛋白为亲水性蛋白,定位在细胞质中;二级结构预测发现其α螺旋和无规则卷曲占比最高,分别达到43.41%和45.88%。原核表达结果表明,SbSGT1最佳表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3),最佳诱导温度和IPTG浓度分别为25℃和0.8 mmol·L^-1。本研究为进一步探究SbSGT1基因在高粱抗病机理中所发挥的生物学功能奠定了基础。     

高粱AGO蛋白家族基因鉴定及表达分析

Argonaute (AGO)蛋白是RNA介导的沉默复合物RISC的核心成分,在小RNA、Dicer?like酶等的协同下共同激发RNA沉默反应。为阐明高粱中AGO蛋白的功能,本研究采用生物信息学的方法首次在高粱全基因组水平鉴定15个SbAGOs,分别定位于高粱的7条染色体上,根据氨基酸序列将其划分为三个亚家族。亚家族Ⅲ中SbAGO7和SbAGO3都含有3个外显子,亚家族Ⅱ中SbAGO4和SbAGO6都具有22个外显子,成员最多的亚家族Ⅰ中基因外显子数量介于19~24之间。其中,亚家族Ⅰ中SbAGO1-1和SbAGO1-3、SbAGO1-3和SbAGO1-4、SbAGO5-2和SbAGO5-4发生过基因复制事件,可能存在功能冗余现象。NCBI表达谱数据库分析发现,SbAGO1-1、SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO4在高粱不同组织器官和生长发育阶段均有较高表达,其中SbAGO1-1和SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO4表达时期和表达量基本一致,可能在调控高粱生长发育方面发挥协同作用。高温、干旱及高温与干旱复合逆境表达谱芯片数据分析发现,高温处理引起5个SbAGOs基因差异表达,干旱处理SbAGOs表达变化不明显,复合逆境引起7个SbAGOs基因差异表达;2个处理共同差异表达基因为SbAGO1-3、SbAGO1-1、SbAGO5-2和SbAGO3,表达量变化趋势相近。其中SbAGO1-1、SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO5-6下调表达,SbAGO3、SbAGO5-2、SbAGO1-4和SbAGO10上调表达。本研究结果为揭示SbAGO蛋白功能和发掘高粱的抗逆育种靶向基因资源提供了一定的理论依据。     

毛竹PheDof2转录因子克隆及表达分析

Dof蛋白是单锌指结构蛋白家族之一,在植物生长发育和非生物胁迫中发挥重要作用.为了探索Dof转录因子在毛竹中的功能及表达特征,本研究以毛竹实生苗为材料,采取反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到PheDof2基因的cDNA序列,对其进行生物信息学初步分析,并检测其在毛竹不同高度笋、花发育,及不同胁迫处理下的表达情况....     

玉米逆境响应基因ZmGST23克隆和表达分析

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是植物抗氧化系统的重要成员,在初生代谢、次生代谢、细胞信号转导及逆境响应等生物学过程中发挥着重要作用.本研究以GenBank中公布的玉米谷胱甘肽-S-转移酶23基因(ZmGST23)mRNA序列(GenBank登录号:NM_001111524)为依据,采用RT-PCR方法从玉米(Zea mays)自交系F83中克隆得到ZmGST23基因669 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码222个氨基酸,蛋白分子量为24.84kD,理论等电点为5.68.保守结构域分析表明,该基因具有GSTs所特有的N端及C端结构域,并含有典型的G位点及H位点,属于Tau类谷胱甘肽硫转移酶.系统进化分析表明,ZmGST23编码蛋白与高粱(Sorghum bieolor)GST蛋白亲缘关系最近,且在不同物种间存在明显的种属特性.启动子序列分析结果显示,ZmGST23基因启动子区含有多个响应逆境及植物激素的作用元件,包括脱落酸(abscisic acid,ABA)响应元件、生长素(auxin,IAA)响应元件、赤霉素(gibberellin,GA)响应元件、厌氧响应元件、防御及逆境响应元件以及干旱诱导的MYB转录因子(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog,MYB)结合位点.胁迫诱导表达分析表明,ZmGST23的表达显著受干旱脱水、水涝、盐、ABA、IAA、GA、低温及高温等非生物胁迫的诱导.组织特异性表达分析表明,ZmGST23基因在幼芽和成熟叶片中表达量较高,在幼根、花丝、苞叶、雌穗及雄穗中表达量较低,存在明显的组织特异性.将ZmGST23基因片段连接至原核表达载体pEASY-E1中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,用0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ3-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达1～4 h后获得30 kD的诱导蛋白.本研究结果为进一步利用该基因进行玉米抗性改良提供了一定的理论依据.     

高粱SbJAZ1基因克隆与表达分析

JAZ1基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为克隆高粱SbJAZ1基因及研究其响应胁迫表达特性,本试验以高粱品种BTx623为研究材料,提取其总RNA,反转录获得cDNA,以cDNA为模板扩增SbJAZ1基因,并对其进行生物信息学、基因表达和原核表达分析。结果显示,SbJAZ1基因全长606 bp,编码201个氨基酸,蛋白质等电点为7.70,分子量大小为21.15 kDa;SbJAZ1与玉米相应同源基因亲缘关系最近,为亲水性蛋白;二级结构中α螺旋占25.37%、延伸链占9.95%、β转角占4.98%,无规则卷曲占59.70%。qRT-PCR分析表明,SbJAZ1在高粱根、茎、芽和叶组织中均有表达,且具有组织表达特异性,在茎中表达量最高;茉莉酸(JA)处理1 h后,SbJAZ1在高粱茎中表达量最高;吲哚乙酸(IAA)和PEG-6000可诱导SbJAZ1的表达。原核表达结果显示,SbJAZ1在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株诱导表达的最佳条件为:温度30℃,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度0.8 mmol·L^-1。本研究结果为SbJAZ1基因的生物学功...     

桃MPK3基因的克隆、表达及生物信息学分析

为探究MPK3响应GA信号调控休眠解除的分子机理,以中油四号油桃为试验材料,通过实时荧光定量PCR发现GA诱导下MAPKs家族基因在桃芽中有不同程度的表达,其中PpMPK3响应GA正调控表现最强烈。利用MEGA6.0、MEME、GSDS、DNAMAN 6.0等软件对桃PpMPK3基因进行生物信息学分析,结果表明,PpMPK3的cDNA全长1 113 bp,编码370个氨基酸,蛋白分子量约为42.6 kD,理论等电点为5.62,属于亲水性不稳定蛋白。预测PpMPK3蛋白发生磷酸化修饰的位点有45个,不存在糖基化位点。PpMPK3蛋白的二级结构中α-螺旋占41.35%,延伸链占10.54%,无规则卷曲为48.11%。进化树分析表明,PpMPK3氨基酸序列与甜樱桃亲缘关系最近,同源性为99.73%。通过亚细胞定位发现,PpMPK3定位于细胞核。RT-PCR结果表明,PpMPK3的表达模式与休眠解除过程相一致,推测PpMPK3能够响应GA信号,促进休眠解除。本研究结果为桃设施栽培的休眠调控提供了一定的理论依据。     

香菇低温胁迫应答基因的克隆及其表达分析

用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术相结合，从香菇(Lentinula edodes)苏香菌株中得到了1个与低温胁迫相关的全长2 432 bp的cDNA，该基因含1个1 962 bp的开放式阅读框，基因组序列分析发现该基因有11个内含子。经数据库同源查找及序列比较，发现该基因编码的氨基酸与青霉菌(Penicillium nordicum)的聚酮合酶和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-氨基己二酸还原酶分别具有30%、22％的同源性和46%、40%的相似性。表达谱分析表明，当低温胁迫的温差为5 ℃时，该基因即开始表达，但mRNA丰度较低；温差达到10 ℃时，mRNA达到最大表达量；低温胁迫处理后，该基因在菌丝转色前的表达丰度低于转色后的丰度。将该基因初步命名为ICS (gene induced under cold stress, GenBank登录号为DQ211659)，并初步推测该基因可能参与了低温胁迫的信号传导，低温胁迫信号在影响氮代谢后进而诱发子实体的形成。     

胡萝卜2个DcDREB-A1类转录因子基因的克隆与比较分析

植物DREB类转录因子在植物抗逆性方面具有重要作用。本文以胡萝卜黑田五寸为材料,基于胡萝卜转录组数据,通过RT-PCR方法克隆出2个DREB-A1类转录因子基因Dc DREB-A1-1和Dc DREBA1-2。序列分析显示,这2个基因均没有内含子,长度分别为780bp和669bp,分别编码259和222个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量分别为29.0KD和24.71KD,p I值分别为4.32和4.63。通过对氨基酸亲水/疏水性进行分析,发现这2个转录因子属于亲水性蛋白。实时定量PCR分析表明,Dc DREB-A1-1和Dc DREB-A1-2基因在胡萝卜不同组织中的表达量不同,分别在叶和根中表达量最高。低温(4℃)、高温(38℃)、盐(0.2 mol·L-1Na Cl)、干旱(200 g·L-1PEG)不同时间段处理表达分析显示,Dc DREB-A1-1在低温、高温、盐和干旱胁迫下被显著诱导,高温、盐和干旱处理1 h后表达量达到最高,分别比对照增加14倍、7倍、7倍,低温处理下2 h表达量最高,是对照的18倍;而Dc DREB-A1-2在高温、低温和盐处理下响应明显,高温处理1 h后表达量为对照的12倍,低温和干旱处理下8 h基因表达量分别比对照增加2.4倍、6.2倍,说明2个基因在响应逆境胁迫时表达不同。胡萝卜响应非生物逆境胁迫是一个复杂的过程,本试验对深入研究胡萝卜抗逆分子机制,提高胡萝卜逆境抗性等方面具有较为重要的意义。     

蓖麻延伸因子基因的克隆与表达分析

为探讨蓖麻延伸因子基因(RcEF-1α)作为参考基因进行相关研究的可行性,以蓖麻雌性花为试验材料,扩增RcEF-1α(GenBank登录号: XM_002518027.3)的编码序列(CDS),并将其亚克隆至原核表达载体pET32a(+)构建成重组载体pET32a(+)-RcEF-1α;将pET32a(+)-RcEF-1α转化至大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)中进行优化表达,表达蛋白经纯化后进行Western blot验证。结果表明,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导一个分子量约66 kD的特异蛋白;采用纯化的表达蛋白免疫新西兰白兔制备抗RcEF-1α的多克隆抗血清,用多克隆抗血清进行Western blot验证,发现多克隆抗血清具有针对RcEF-1α的特异性,经ELISA检测,其效价为1∶51 200;以抗血清为一抗,通过Western blot分析RcEF-1α在时空条件一致且正常生长的根、茎、叶、雌花、雄花和果实中的表达量,结果显示,蓖麻各组织中RcEF-1α蛋白质的含量存在显著差异,其中雌花和雄花中的含量显著高于其他组织。RT-qPCR分析结果表明,蓖麻各组织中RcEF-1α mRNA差异不显著。本研究结果为蓖麻功能基因表达分析参考基因的筛选提供了一定的理论依据。     

小麦胁迫响应转录因子基因TaSNAC1的克隆与表达分析

胁迫响应NAC转录因子参与植物非生物胁迫过程,过表达水稻(Oryza sativa)SNAC1可显著提高植株耐旱、耐冷和抗盐性。本研究同源克隆了小麦(Tricum aestivum)TaSNAC1基因(GenBank登录号No.JN621240),分析了其表达产物的亚细胞定位,并利用实时定量RT-PCR分析了其在不同组织、PEG和NaCl胁迫下的表达。该基因包含一个内含子,编码329个氨基酸残基的蛋白产物。TaSNAC1与其他禾本科植物SNAC1蛋白高度相似,其与大麦(Hordeum vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻、玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)SNAC1序列相似性依次为97.3%、86.3%、81.1%、79.1%和79.2%。TaSNAC1可能以二聚体形式存在,包含核定位信号和典型的NAM结构域,100~107位的"WKATGXDK100-107"核心基序处于一段β折叠中,其弯曲产生的凹面可能直接参与DNA结合。瞬时转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶肉细胞原生质体的实验表明,TaSNAC1特异定位于细胞核中。盐胁迫条件下,叶和根中TaSNAC1的表达量均升高,且表达模式相似,但根中响应更显著;PEG胁迫下,根中TaSNAC1对胁迫的响应较快且幅度较大,而叶中响应较慢且幅度较小。研究结果提示,TaSNAC1参与小麦的非生物胁迫响应过程,在耐旱、抗盐遗传改良中具有潜在应用价值。     

大蒜谷胱甘肽硫转移酶基因AsGST的克隆及其对盐胁迫的响应

为了解大蒜GST基因及其编码的蛋白质的结构特征,分析GST基因在不同组织及盐胁迫条件下的表达特性,采用RT-PCR方法克隆得到大蒜苍山四六瓣GST基因,采用BLAST、DNAMAN、ProtParam、MEGA5、Swiss-Model等生物信息工具分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR方法,分析AsGST基因在大蒜根、鳞茎和叶片中的表达差异及其对盐胁迫的响应情况。结果表明,大蒜AsGST基因全长663 bp,编码220个氨基酸,推测蛋白质分子质量为25.58 kDa,理论等电点为6.55,属于tau类GST家族。植物GST的序列相似性较低,但在结构上相对保守。在蛋白的N端含有谷胱甘肽特异结合位点(G位点),C端含有可变性较大的疏水底物结合位点(H位点),在进化关系上AsGST与茄科作物较近。空间结构分析表明,大蒜GST的三级结构由3个β-折叠和11个α-螺旋构成。实时荧光定量PCR显示,苍山四六瓣中GST基因在根中的表达量最高,其次是叶,在鳞茎中的表达量较低,具有明显的组织特异性。盐胁迫处理4 h后,各组织内AsGST基因的表达量均升至最高,说明该基因可响应盐胁迫逆境信号。本研究结果为进一步研究大蒜GST基因的功能奠定了一定的理论基础。     

高粱病程相关基因非表达子1(NPR1)基因家族鉴定及胁迫应答分析

非表达因子基因(NPR1)是植物系统获得抗性的激活子,也是植物响应病原菌侵染过程中的核心因子之一,在植物抗病性方面发挥着非常重要的作用.为明确高粱NPR1基因家族成员及SbNPR1的表达特性,本研究通过生物信息学及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对高粱NPR1基因家族进行鉴定和表达分析.结果表明,共鉴定到5个...     

番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

猪小脂肪细胞因子1（SMAF1）基因cDNA的克隆及表达谱分析

采用比较基因组学和RT-PCR方法，根据人和小鼠SMAF1基因的保守序列，设计简并引物，克隆了猪SMAF1基因的cDNA序列。所克隆片断全长256bp（GeneBank登录号 DQ191892），包括一个编码了81个氨基酸的完整编码区，该序列与人和小鼠的SMAF1基因的相似性分别为86%和78％，预测的氨基酸序列与人、小鼠、大鼠和牛的相似性分别为81％、67％、70%和84%。猪SMAF1基因在脂肪组织中高丰度表达，在4月龄瘦肉型猪（大白猪）脂肪组织中的表达量显著低于脂肪型猪（梅山猪）（P＜0.05）。本研究结果表明，猪SMAF1基因可能具有和其它物种SMAF1基因相似的功能，推测其在脂肪细胞发生和/或脂肪细胞功能中具有重要的调控作用。     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

小桐子过氧化物酶73基因的克隆及表达分析

过氧化物酶73属于植物特异Ⅲ型过氧化物酶家族成员,通过消除活性氧、酚类及胺类等毒害作用参与植物多种抗逆性形成过程。为探索小桐子POD73基因对低温环境的响应机制,本研究基于小桐子低温锻炼转录组数据,以茎为材料,采用RT-PCR技术克隆到小桐子过氧化物酶73基因(Jc POD73)的全长c DNA序列。结果表明,该c DNA全长1 516 bp,含有完整的开放阅读框(987 bp),编码328个氨基酸,分子量为35.8 k Da,理论等电点为9.16。其推导的氨基酸序列及空间结构,包含该家族典型的2个Ca2+结合基序以及血红素活性中心。半定量RT-PCR表达分析显示,Jc POD73在小桐子各组织中都有表达,但表达水平具有组织特异性,其中在根与茎中表达量较高,且受低温诱导表达显著,而在叶中表达量相对较低。本研究为进一步阐明小桐子POD73基因的功能及其在小桐子遗传改良中的应用奠定了基础。