苦瓜果实酵母双杂交文库构建及McRPF互作蛋白筛选

为研究苦瓜果实成熟的分子调控机制,以苦瓜自交系E12201-e1为材料,取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合,采用All-Direct方法构建酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库库容为1.25×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 200 bp,阳性率为100%,文库质量较高,符合建库标准。同时,以苦瓜果实成熟关键调控因子McRPF为诱饵,构建诱饵表达载体pGBKT7-McRPF。经鉴定该诱饵蛋白无自激活活性。利用共转化法,从文库中筛选到29个初始阳性菌落,经过DNA测序和BLAST比对分析,最终筛选得到12个可能与McRPF互作的蛋白,为进一步探究McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了理论基础。     

海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与GbTCP5互作蛋白的筛选

为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7- GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×10⁷ cfu·mL^-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。     

非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×10⁷ CFU,次级文库总克隆数为1.6×10⁷ CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×10⁷ cells·mL^-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本...     

烟草NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选

为探究NtMYB4a是否与其他蛋白质发生互作,并共同影响烟草次生代谢产物的合成和响应非生物胁迫,通过构建NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体,从烟草cDNA文库中筛选出与NtMYB4a互作的候选蛋白,并利用实时荧光定量PCR初步验证低温胁迫下候选蛋白和NtMYB4a的共表达关系。结果表明,从cDNA文库中初步筛选出39个与NtMYB4a互作的蛋白,经回交验证排除假阳性,最终得到6个与NtMYB4a具有互作关系的蛋白,分别是RALF-like 22蛋白、锌指A20/AN1结构域蛋白、液泡分选蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和应激增强蛋白。在低温胁迫下,6种互作蛋白的基因表达量变化趋势与NtMYB4a相似,均呈升高—降低—升高的趋势。相关性分析发现,液泡分选蛋白、B2蛋白、RALF-like 22蛋白和应激增强蛋白基因的表达与NtMYB4a的表达呈正相关关系,锌指A20/AN1结构域蛋白和天冬氨酸蛋白酶基因的表达与NtMYB4a的表达呈较弱的负相关关系,推测NtMYB4a可能与这些蛋白互作参与烟草低温胁迫的防御调控。本研究结果为进一步探究NtMYB4a参与响应非生物胁迫的分子调控机制提供了依据。     

酵母双杂交筛选水稻OsMADS15互作蛋白

蛋白间的相互作用对于生物学功能的发挥是非常重要的.MA DS-box基因的功能主要通过形成同源或异源二聚体或四聚体来实现.水稻OsMA DS15是一个AP1/SQUA亚家族的成员,在水稻开花时间调控、不定根的发育、茎的生长和内稃的发育等过程中具有重要作用,但与之有相互作用的蛋白却知之甚少.本实验用酵母双杂交法从水稻(Oryza sativa ssp.japonica)cDNA文库中筛选与OsMA DS15有相互作用的蛋白.构建了pGB KT7-OsMA DS15诱饵表达载体,然后与pGADT7-cDNA library共转化到酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109中,通过顺序筛选HIS3、A DE2和LacZ3个报告基因的表达,共得到25个UniGene.在烟草(Nicotiana benthamiana)细胞中用BIFC实验验证OsMADS15和候选基因OsMA DS1、OsMA DS14、Os MA DS8之间的相互作用,结果表明在烟草细胞的核内,OsMADS15相连的nYFP可以与OsMA DS1、OsMA DS14、Os MA DS8相连的cYFP分别形成互补而产生荧光,证实其间在植物体内也具有相互作用.本实验为今后近一步研究OsMADS15在水稻花发育和水稻营养器官生长发育中的功能提供了基础资料.     

不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建及BcFT上游调控因子筛选

FLOWERING LOCUS T(FT)是调控植物开花途径中的关键基因,前期研究中,在比较晚开花wym-97和早开花cx-49两个品种的BcFT启动子时,发现cx-49的BcFT启动子存在一个1 577 bp的插入片段。为探索该插入片段对不结球白菜开花的影响,本研究构建不结球白菜酵母杂交cDNA文库,继而利用酵母单杂交技术筛选与BcFT启动子互作的蛋白。结果显示,本研究所得cDNA文库的库容为1.8×10⁶ CFU,重组率为100%,插入片段长度分布范围约400～2 000 bp,平均长度大于1 000 bp,表明不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建成功。自激活试验表明,800 ng·mL^-1的金担子素(AbA)可以抑制诱饵载体的自激活。通过酵母单杂交试验筛选到结合BcFT启动子插入片段的上游蛋白BcSAP18和BcDEAR2。综上,本研究成功构建了不结球白菜酵母杂交cDNA文库并获得了BcFT启动子插入片段的互作蛋白,为进一步研究BcFT在不结球白菜开花中的调控机制奠定了基础。     

棉花品种黄萎病抗性与免疫反应的关系

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的土传真菌病害,不同棉花品种对黄萎病的抗性不同。为了比较不同棉花品种对黄萎病菌的免疫反应程度与抗黄萎病水平间的关系,利用4×106CFU·m L~(-1)的大丽轮枝菌孢子悬浮液处理6个不同棉花品种的根系,进行抗病性评价。结果表明,接种大丽轮枝菌后,棉花植株的根、下胚轴、叶等器官中大丽轮枝菌的生物量随品种抗病性的增强而减少,根部木质素、叶片胼胝质含量随抗病性的增强而增多,L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的升高幅度随抗病性的增强而增大。由此可见,大丽轮枝菌侵染棉花后,植株的免疫反应程度越强其抗病性越强。本研究结果为棉花与黄萎病菌互作机制的进一步研究提供了理论依据。     

应用酵母双杂交系统筛选与CASTOR相互作用的蛋白

CASTOR编码百脉根中的离子通道蛋白，它是共生途径上的功能基因，作用于结瘤因子诱导产生的钙离子激增（calcium spiking）信号转导途径的上游，突变后不能形成根瘤。为了进一步揭示CASTOR调控共生信号途径的分子机制，本文通过酵母双杂交系统在百脉根的cDNA文库中筛选可能与CASTOR相互作用的蛋白，以酵母配合的方法初筛获得111个阳性克隆，经β- Gal检测进一步确认有99个蓝色克隆子，测序以及NCBI BLAST比对分析鉴定出JAB1、CLPA、钙调素结合的翻译延伸因子等7种可能与CASTOR相互作用的蛋白，利用RT-PCR方法检测了这些基因在接种以及不接种根瘤菌的百脉根中的表达水平，分析推测CASTOR可能与上述蛋白形成复合物参与共生信号的转导。     

SRBSDV侵染的白背飞虱中肠酵母双杂交cDNA文库的构建和分析

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)成员,主要由白背飞虱(Sogatella furcifera,WBPH)以持久增殖型方式进行传播.在病毒的侵染循回过程中,白背飞虱中肠上皮细胞是病毒的初侵染和主要增殖场所.而病毒的有效增殖是决定介体能否传毒的关键影响因素.为了更好地研究SRBSDV和介体白背飞虱的互作关系,尤其是了解白背飞虱中肠蛋白通过参与调控病毒的增殖过程,而使介体昆虫成功获毒并传毒,本研究以高带毒白背飞虱群体中肠组织为实验材料,构建了高带毒白背飞虱群体中肠的酵母双杂交cDNA文库.经过检测表明,构建的文库滴度为1.5×106 cfu/mL,平均插入片段主要分布在1.0～2.0 kb之间,文库质量较好,可用于研究SRBSDV编码蛋白和白背飞虱中肠蛋白的互作关系,并为开展SRBSDV和昆虫介体的互作研究奠定了基础.     

稻瘟病菌发育cDNA文库构建与表达序列标签分析*

利用稻瘟病菌(Magnaporthegriesa)连续6个发育时期的材料构建了一个混合cDNA文库。文库滴度,重组率和插入片段长度等质量分析表明,构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因,可用于病菌基因表达分析。利用该文库获得了7456条5′端表达序列标签(ESTs)(GenBank收录号:(CK909944￣CK913666和CK928583￣CK932582),生物信息分析表明:EST序列拼接出2975个假定独立转录本(TUTs),冗余度为60.1%;从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的79.8%,说明在文库中基因组成类型的复杂性较高;在所有TUTs中,功能未知基因约占85.5%,编码ECM33蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达,进一步表明该cDNA文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。     

Zinc Application Enhances Biological Yield and Alters Nutrient Uptake by Cotton (Gossypium hirsutum L.)

Zinc (Zn) deficiency is often associated with calcareous soils throughout the world, whereas application of Zn not only enhances biological yield but exhibits significant interactions with nutrients. Hence, a two-year field experiment was performed in 2004 and 2005 to assess the crop Zn requirements as well as nutrient interactions in cotton. The present study followed a randomized complete block design with five Zn levels: 0.0, 5.0, 7.5, 10.0, and 12.5 kg Zn as ZnSO₄.7H₂O. The biological yield of cotton increased progressively with increasing Zn rates. In general, cotton yield was higher in 2005 over 2004. Interestingly, Zn fertilization resulted in increased accumulation of nitrogen (N), potassium (K), boron (B), and Zn, whereas decreased the phosphorus (P), calcium (Ca), magnesium (Mg), iron (Fe), copper (Cu), and manganese (Mn) (p ≤ 0.05) uptake by cotton. The enhanced macronutrients accumulation in cotton by Zn application improved the cotton yield. In conclusion, biological yield and nutrient composition of the cotton plant are greatly influenced by Zn supply under irrigated environments.     

Evaluating the effectiveness of biofertilizer on salt tolerance of cotton (Gossypium hirsutum L.)

In the present study, the effectiveness of biofertilizer containing plant growth promoting rhizobacteria was evaluated on growth and physiology of cotton under saline conditions. Cotton plants were exposed to different levels of NPK (50%, 75%, and 100% of recommended levels) along with coating with biofertilizer under saline (15 dS m^?1) and non-saline conditions. It was observed that the biofertilizer seed coating improved growth, physiological (relative water content and chlorophyll content index), and ionic (K⁺/Na⁺) characteristics under saline and non-saline conditions. However, shoot growth (shoot fresh and dry weight) and leaf gas exchange characteristics (CO₂ assimilation rate, A; intercellular CO₂ concentration, C_i; transpiration rate, E; stomatal conductance, g_s) were decreased by biofertilizer coating under saline condition. Increasing levels of NPK fertilizer increased shoot growth, whereas root growth was maximum at 75% NPK level under saline conditions. The results of the study indicate that the biofertilizer application was very effective for cotton plant in non-saline conditions but not very effective in saline conditions.     

Effect of Syrian Indigenous Arbuscular Mycorrhizal Fungi in Combination with Manure on the Growth of Cotton (Gossypium hirsutum L.)

A pot experiment was conducted to evaluate the effect of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the synergy of indigenous AMF and sheep manure (SM) on cotton growth and nitrogen and phosphorus uptake. AMF were a mixture of Glomus viscosum, Glomus mosseae, and Glomus intraradices initially isolated from a Syrian cotton field. Dry biomass was enhanced significantly by AMF and was higher at AMF plus SM treatment compared to control. Cotton plants showed a significant dependency to indigenous AMF, which was 52% in the AMF treatment. Plant concentrations of nitrogen (N)and phosphorus (P) were significantly higher in mycorrhizal than nonmycorrhizal plants. Maximum plant N and P uptake was found in the treatment of AMF inoculation with SM, which was significantly higher by 202% and 397% over control, respectively. Indigenous AMF was successful in colonizing cotton roots and when combined with SM resulted in better plant growth and N and P uptake.     

棉花Bax inhibitor-1基因启动子的克隆及初步验证

为研究克隆自陆地棉的GhBI-1A和GhBI-1B基因的表达差异及其响应不同物生和非生物胁迫的分子机制,利用BD GenomeWalkerTM Universal Kit的染色体步移技术得到了2个棉花GhBI-1A和GhBF1B基因5’端上游的启动子序列,长度分别为1650bp和2001bp.生物信息学分析表明,GhBI-1A和GhBI-1B的启动子序列均存在TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件,GhBI-1B启动子中还含有真菌诱导应答元件.以表达载体pBI101为基础,用所克隆的2个棉花GhBI-1基因启动子序列与GUS报告基因融合,构建新的植物表达载体并转入农杆菌.用叶盘法侵染烟草进行瞬时表达,结果表明2个启动子均能够驱动报告基因的表达.     

利用复合杂交群体定位陆地棉纤维品质性状QTL

为发掘陆地棉纤维品质性状基因/数量性状基因座(quantitative trait loci,QTL),本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)优质品种渝棉1号分别与贝尔斯诺和中棉所35杂交获得F1代,随后利用两个F1再次杂交得到复合杂交群体.利用6565对SSR引物筛选渝棉1号、中棉所35和贝尔斯诺,获得155对多态性引物.对检测[(渝棉1号×中棉所35)x(渝棉1号×贝尔斯诺)]F1复合杂交群体标记基因型获得的158个位点进行遗传连锁分析,构建的遗传图谱包含102个位点,覆盖1199.0 cM.利用多QTL(multiple-QTL model,MQM)作图法,检测到11个纤维品质性状QTL,包括4个纤维长度、2个长度整齐度和5个纤维比强度QTL.11个QTL分布于4条D基因组染色体.本研究表明,陆地棉不同品种同一纤维品质性状QTL等位基因存在差异;三亲本杂交群体不仅可以提高群体多态性分子标记比例,而且可以显示同一QTL在不同遗传背景的等位基因表现差异.     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP6的克隆及表达初步分析

为探究ROP基因在棉花抵御逆境胁迫中的生物学功能,利用同源克隆的方法获得一个陆地棉GhROP6基因,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术探究GhROP6基因的组织表达特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式,构建GhROP6基因的VIGS载体并转化棉花,利用qRT-PCR技术检测其沉默效率。结果显示,GhROP6基因开放阅读框（ORF）为597 bp,编码一个含198个氨基酸的I类ROP蛋白;多重序列比对结果显示,GhROP6符合ROP蛋白结构特征,且与其他物种ROP蛋白高度同源;进化树分析结果显示GhROP6蛋白与拟南芥AtROP6蛋白同源性最高;GhROP6基因在棉花根、茎、真叶及子叶中均有表达,且在真叶中表达量最高;GhROP6基因对干旱、高盐、低温、高温等胁迫和外源脱落酸（ABA）、生长素（IAA）处理均有不同程度的响应,可能在棉花抗逆反应中扮演着重要角色。GhROP6在棉花的叶片和根部均得到有效沉默,表明已获得GhROP6基因沉默植株。本研究为进一步了解GhROP6基因的分子生物学功能奠定了基础。