桑树中miR319的克隆及在雄花发育中表达分析

为探究miR319及靶基因在调控桑树雄花发育的分子机制,本研究通过石蜡切片技术判断桑树雄花芽发育时期及在线网站预测miR319的靶基因。结果表明,桑树雄花芽发育分为未分化期(A1)、分化初期(A2)、花序分化期(A3)和总苞形成期(A4)4个不同的阶段;桑树中miR319家族存在miR319a、miR319b和miR319c 3个成员,其中miR319b与miR319c位于同一条前体序列上,预测并获得了miR319 6个靶基因。运用5'-RACE技术验证了miR319a的4个靶基因,其切割位点主要集中在与miRNA互补位点的第10和第11位碱基之间。采用RT-qPCR技术检测miR319a及靶基因在雄花发育不同阶段的表达水平,发现miR319a在雄花发育A2-A3阶段表达水平迅速降低,靶基因Morus012208、Morus008229、Morus008100与Morus005893在此阶段表达水平迅速升高,茉莉酸(JA)含量也迅速升高。同时,JA合成关键基因PLDα1和LOX5在雄花发育A2-A3阶段表达上调,表明miR319通过调控靶基因影响JA合成来调控桑树花序分化。本研究为揭示桑树miR319在JA途径中调控花发育中的分子调控机制奠定了一定的理论基础。     

梅PmmiR319a与靶基因PmTCP2的验证与表达分析

为验证PmmiR319a与PmTCP2基因的靶标关系,并研究PmmiR319a在梅花芽发育过程中的作用,本研究以梅品种‘大嵌蒂’为试验材料,克隆梅PmmiR319a前体序列及其靶基因PmTCP2,采用5'RACE技术对两者之间的靶标关系进行验证,并进一步分析在花芽发育过程中的表达模式。结果表明,梅PmmiR319a前体序列含有茎环结构,通过序列比对和系统发育分析发现,不同物种的miR319a前体序列的茎环发卡结构和成熟体区域表现出较高的保守性。梅PmTCP2基因全长1 500 bp,编码499个氨基酸。荧光定量PCR分析结果表明,PmmiR319a在梅花发育的前期表达量高,而PmTCP2在梅花发育的中期和后期表达量较高,PmmiR319a与预测靶基因PmTCP2的表达模式呈负相关,表明二者存在负调控的关系,与预测的靶标关系一致。RLM-5'RACE技术验证结果表明,PmmiR319a对其靶基因PmTCP2的mRNA进行了切割,切割位点位于第10和第11个碱基之间。由此可知,PmmiR319a通过调控靶基因PmTCP2影响花的发育。本研究结果为阐明梅花中miR319a的功能提供了一定的理论依据。     

桑树miR164及靶基因NAC在甘露醇和NaCl胁迫中的表达分析

为探索miR164及靶基因在非生物胁迫响应中的分子机制,本研究以冀桑3号为试材,进行Na Cl和甘露醇处理,采用生物信息学、5'-RACE及RT-q PCR技术进行分析。通过在线网站预测,发现在桑树NAC基因家族中存在3个基因(Morus012149、Morus013575与Morus006482,分别命名为CUC2、NAC100a与NAC100b)为miR164的靶基因。运用5'-RACE技术验证了3个NAC基因为miR164靶基因,其切割位点主要集中于与miRNA互补位点的第10和第11位碱基之间。使用RT-q PCR技术检测miR164及靶基因在不同组织部位的表达水平,结果表明,miR164在茎和雄花中通过调控CUC2、NAC100a和NAC100b表达发挥生物学功能。用甘露醇处理桑树幼苗,在低浓度下(150 mmol·L-1)miR164在叶片中表达量显著高于对照组,高浓度下(300 mmol·L-1)miR164表达量接近于对照组;用Na Cl处理,miR164在叶片中的表达水平随着处理浓度的增大而增加。3个靶基因在不同处理不同浓度下表达水平不同。本研究结果有助于揭示桑树miR164及靶基因NAC的抗逆作用,为进一步深入研究miR164对NAC在非生物胁迫响应中的分子调控机制提供了理论依据。     

光皮桦miR393及其靶基因在低氮胁迫中的表达分析

为探讨光皮桦低氮胁迫中miR393调控机制,以光皮桦(Betula luminifera)G49-3无性系为材料,分为两组处理,低氮组以含0.03 mmol·L~(-1)NO3-的营养液浇灌,对照组以含15 mmol·L~(-1)KNO3的全营养液浇灌,分别处理1、2、4、21 d,另设一组恢复试验组(Re),低氮处理4 d后重新添加全营养液。探讨miR393及其靶基因(TIR1)与(AFB2)在低氮胁迫下的表达响应。应用RT-PCR和RACE技术克隆了Bl TIR1(Gen Bank登录号:KX771075)和Bl AFB2的c DNA序列(Gen Bank登录号:KX771074),其中Bl TIR1序列全长2 387 bp,编码582个氨基酸,Bl AFB2序列全长2 373 bp,编码572个氨基酸;2个基因预测的氨基酸序列中N端具有F-box保守结构域,5个LRR结构域;运用5'-RACE验证了miR393对预测靶基因Bl TIR1和Bl AFB2的剪切作用及靶作用位点,且靶作用位点均在靶基因中从miR393 5'端起与miR393配对的第10和第11位碱基间;采用RT-q PCR分析了miR393与2个靶基因低氮胁迫时的表达模式,结果表明,miR393a相对表达量最高,可能在低氮胁迫中发挥主要调控作用。在根和叶中,miR393a表达水平在低氮处理前期(2、4 d)受到抑制,而后升高,且在恢复试验组中,miR393a均显著上调,且miR393a与靶基因Bl AFB2在叶中呈显著负相关;在茎中,4 d时miR393a显著上调而在恢复试验组中显著下调。miR393及其靶基因Bl TIR1和Bl AFB2在光皮桦低氮胁迫处理中的表达模式暗示其可能在低氮胁迫响应中发挥调控功能。本研究结果对于阐明光皮桦miR393—Bl TIR1/Bl AFBs在低氮胁迫响应中的调控功能,揭示林木应对低氮胁迫的分子基础具有重要理论意义。     

热胁迫下水稻miR396家族及靶基因OsGRFs的表达研究

miRNA是真核生物体内一类非编码的小RNA,在动植物发育过程中发挥重要作用,但迄今为止,其在水稻耐高温方面的分子机理研究很少。为进行水稻(Oryza sativa)高温胁迫下miRNA的功能研究,前期通过小RNA测序发现,miR396家族是响应水稻高温胁迫最显著的家族。为了进一步研究miR396家族响应高温胁迫的分子机制,本研究对水稻日本晴(Oryza sativa spp.japonica cv.Nipponbare)苗期叶片进行不同时间48℃高温处理,通过q RT-PCR法分析8个miR396家族成员以及12个预测的靶基因生长调节因子(growth regulating factor,GRF)家族的表达情况。结果显示,miR396家族8个成员及12个预测靶基因对高温胁迫应答不同。miR396a、miR396e和miR396f在每个时间的高温胁迫呈上升表达,而miR396b,miR396c,miR396d,miR396g,miR396h在1.5、3、6 h呈下降表达,在12、24 h呈不同程度上升表达;miR396a、miR396e和miR396f在高温胁迫下上升表达10倍以上,其中miR396f上升100倍以上。Os GRF家族随高温胁迫呈不规律的上升或下降表达,其中Os GRF2随着胁迫时间增加持续下降表达至8~10倍。并且Os GRF2与miR396a、miR396e和miR396f的表达呈高的负相关,表明Os GRF2为miR396a、miR396e和miR396f的靶基因。研究结果表明miR396在水稻耐高温方面有关键作用。     

甜杨低温响应microRNAs的克隆与分析

MicroRNAs（miRNAs）作为一类21碱基左右的非编码小RNAs,参与植物生长发育的调控,并在植物对生物与非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。本研究依据miRNA高度保守特点,利用已公布的毛果杨（Populus trichocarpa）基因组序列设计引物,从甜杨（Populus suaveolens）基因组中克隆获得了12个miRNA基因座序列。序列比对结果表明,这些miRNA基因均为毛果杨低温响应miRNA基因的同源序列。同时,以低温（0℃）处理0～48h的甜杨幼苗为试材,通过半定量RT-PCR法对miRNA基因的成熟体序列在不同处理时间下的表达谱进行分析,结果显示,大多数miRNA成熟体序列在甜杨低温胁迫下的表达模式与其在毛果杨中的表达极为相似,由此可推测这些保守性miRNAs可能在甜杨和毛果杨两物种对低温胁迫的应答反应中发挥相似的功能,而miR168a、miR168b和miR475a在两物种间表达现象的差异,表明它们可能通过调控多种靶基因而发挥不同作用。本文结果将为进一步研究甜杨基因功能提供基础。     

山核桃miR169克隆及功能分析

为探究山核桃miR169(cca-miR169)序列特征及功能,本研究利用生物信息学及分子生物学方法对山核桃中miR169进行分析。通过构建miR169系统进化树发现,双子叶植物和单子叶植物明显的分布在2个支上,且cca-miR169聚类在双子叶分支上;序列分析表明,miR169在双子叶植物上的保守性大于单子叶植物。通过在线预测网站在拟南芥数据库和山核桃转录组数据库中对ccamiR169进行靶基因预测,在2物种中分别获得4个和3个靶基因,且AT2 G41820与Unigene17062为同源基因;表达分析表明,AT2G41820与Unigene17062在花发育时期表达量均呈下降趋势。在拟南芥中过表达cca-miR169发现,转基因植株开花较野生型提前4 d。对转基因植株及野生型植株中开花相关基因进行qRT-PCR分析,结果表明,开花促进因子LFY基因在转基因植株中表达量明显上调。cca-miR169具有较强的序列保守性,在拟南芥中过表达cca-miR169能够促进拟南芥提前开花,表明cca-miR169在山核桃中通过作用下游基因可以调节植物花发育。本研究结果为进一阐明山核桃成花调控机制提供了试验依据。     

低温胁迫响应的甜杨miR475靶基因的预测及表达

MicroRNAs（miRNAs）通过使靶mRNA降解或翻译参与生物体的转录后调控,并在植物对生物与非生物胁迫的应答过程中发挥重要作用。本研究基于相关数据库,利用生物信息学方法,通过搜索预测及实验验证得到甜杨（Populus suaveolens）低温响应miR475的12条潜在靶基因,并对其降解位点进行分析;同时,以低温（0℃）处理不同时间甜杨幼苗为试材,利用荧光定量PCR对miR475及其靶基因的表达谱进行检测分析,结果发现,随着低温诱导时间的延长,miR475表达量呈下调趋势,而其靶mRNA的表达量则呈现相反趋势,表明甜杨miR475可能以降解靶mRNA的方式在抵御低温中发挥作用。本文研究结果可为甜杨抗冻机制的后续深入研究提供科学依据。     

microRNA-148a通过锚定ROCK1促进肌原细胞分化

microRNA(miR)是一类长度约18~22nt的进化保守的小RNA,可以通过结合到许多基因的3’UTR调控基因的转录后表达。研究表明,许多miR是骨骼肌发育的关键调节子。最近,中国农业科学院和华中     

慢病毒介导shRNA干扰颗粒体蛋白前体(GRN)促进猪前体脂肪细胞分化

为研究颗粒体蛋白前体(granulin,GRN)在脂肪细胞发育过程中的作用,本实验构建了GRN短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA的表达变化情况。结果显示,GRN慢病毒干扰载体病毒滴度在5×107TU/mL以上,病毒感染前体脂肪细胞后显著降低了GRN的表达,shRNA2干扰效率最高,达到76%,沉默GRN后能够促进猪前体脂肪细胞分化;脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白(SREBP-1c)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(ap2)和脂蛋白酯酶(LPL)基因mRNA表达量均升高。结果表明,降低GRN基因表达促进了猪前体脂肪细胞分化,揭示GRN在猪前体脂肪细胞分化过程中可能起到抑制作用。     

iTRAQ蛋白质组学分析揭示西瓜响应CGMMV胁迫的蛋白质

黄瓜绿斑驳花叶病毒病(CGMMV)是一种危害西瓜生产的检疫性病害.为了在蛋白质水平研究西瓜对CGMMV的胁迫应答,本研究采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术对CGMMV接种前后的西瓜叶片进行蛋白质组学分析,获得参与CGMMV胁迫应答的差异表达蛋白质(DEPs),并对DEPs进行KEGG功能分析;利用Cytos...     

黄秋葵对南方根结线虫抗性的转录组分析

为了解黄秋葵抗南方根结线虫相关基因组学,利用Illumina Hi-seq TM2500高通量测序技术研究受南方根结线虫侵染后黄秋葵种质12C2转录组基因的差异表达。结果表明,接种南方根结线虫18 h后,从接种和未接种的黄秋葵种质12C2根尖中共获得71.49 Gb有效数据,Q30碱基百分比均达到94.0%以上。共获得2 318个差异表达基因(DEGs),包括1 156个上调基因,1 162个下调基因,其中功能注释基因2 202个。根据unigene库序列进行GO、KOG和KEGG注释,细胞壁代谢相关基因——内切葡聚糖酶基因家族、聚半乳糖醛酸酶基因家族、葡聚糖内-1,3-β葡糖苷酶基因家族和果胶裂解酶基因家族下调表达,植物激素代谢相关基因——生长素响应蛋白基因、生长素流入运输载体基因下调表达,茉莉酸合成酶基因上调表达,调控相关基因表达的WRKY和MYB转录因子基因家族上调表达,参与植物细胞的膜联蛋白基因家族上调表达,植物细胞周期蛋白基因家族下调表达。本研究结果为开展黄秋葵抗南方根结线虫基因组学和分子生物学研究奠定了基础。     

菜心BrAGL24基因mRNA在嫁接体中的长距离运输分析

为研究结球甘蓝/菜心嫁接体中开花调控基因的mRNA是否从砧木向接穗进行了运输,本试验以参与开花调控的菜心AGL24基因为研究对象,构建结球甘蓝菜心异源嫁接体,并从接穗结球甘蓝中鉴定菜心AGL24的序列。结果表明,利用结球甘蓝和菜心的转录组测序数据,拼接获得了结球甘蓝和菜心的AGL24基因序列(BoAGL24和BrAGL24)。利用菜心BrAGL24基因中的种间差异序列(C1~C7),在异源嫁接(结球甘蓝/菜心嫁接)的接穗结球甘蓝茎尖的转录组测序文库(T2)中筛选得到2条来自砧木菜心BrAGL24的reads。利用结球甘蓝BoAGL24的种间差异序列(G1~G7),分析结球甘蓝内源BoAGL24基因的转录表达量,发现异源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量总体上高于同源嫁接的结球甘蓝茎尖中AGL24的表达量。异源嫁接使砧木菜心BrAGL24基因的mRNA运输到接穗结球甘蓝中,且增加了接穗结球甘蓝茎尖中内源BoAGL24基因的转录表达水平。本研究鉴定了菜心BrAGL24基因的mRNA运输特性,为进一步研究AGL24基因的mRNA运输与结球甘蓝/菜心嫁接启动接穗结球甘蓝开花机制奠定了一定的理论基础。     

药用植物金银花Dof基因家族的筛选及表达分析

Dof(DNA-binding one zinc finger)蛋白是一类植物所特有的转录因子,N-末端具有高度保守的C₂-C₂单锌指结构域,C-末端的转录调控区的氨基酸具有高度多样性,其在植物光合、细胞周期及逆境响应等过程中发挥着重要的作用。本研究基于金银花测序数据,利用生物信息学的方法筛选了候选的LjDof基因,并对其理化性质、亚细胞定位、同源序列比对、保守基序、系统进化发育和表达模式进行了深入分析。结果表明,金银花Dof转录因子家族包含11个基因,编码的氨基酸的个数为157~492,理论等电点为5.45~9.48,均为不稳定亲水性蛋白。亚细胞定位显示,LjDof基因都在细胞核中有定位,个别在其他部位也有定位。同源比对和Motif分析发现,11个LjDof基因都含有完整的C₂-C₂单锌指结构。系统进化发育分析表明,金银花Dof蛋白分为五个亚类。实时荧光定量PCR及表达模式分析表明,LjDof基因在金银花低温胁迫不同时间下有着不同的表达规律。本研究结果为进一步研究金银花Dof基因在逆境胁迫下的功能提供了理论基础。     

辣椒BES1基因家族鉴定及表达分析

BES1基因是油菜素内酯信号途径中的关键转录因子。为了解辣椒中BES1基因家族功能,以已测序辣椒CM334为试验材料,根据已公布辣椒基因组数据,本研究利用生物信息学方法对辣椒BES1基因家族进行鉴定,并对基因结构、结构域、系统进化关系、基因表达模式和生物非生物胁迫表达情况进行分析。结果表明,辣椒中有9个候选BES1基因,根据BES1基因结构可将其分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大类,Class Ⅰ 和 Class Ⅱ 在结构上差异较大。辣椒BES1编码蛋白介于181~713个氨基酸范围内,分子量为20.22~78.23 kDa,等电点介于5.48~9.23。转录组数据分析发现,辣椒BES1基因在辣椒中表达具有差异性。在脱落酸、低温、高温、茉莉酸甲酯和疫病胁迫下CA04g20150和CA12g17430均被诱导上调,表明其在生物和非生物胁迫中发挥作用。本研究结果为进一步探究BES1基因家族调控植物抗逆的分子机制奠定了基础。     

温度胁迫对幼体大海马基因转录表达的影响

为探究大海马幼体在高温和低温胁迫条件下基因表达水平的变化规律,采用Illumina平台的PE150测序功能对大海马幼体肝脏进行了转录组测序。对照组、高温胁迫组和低温胁迫组测序数据组装后获得22 513个单基因簇(Unigene),N50为2 223 bp,平均长度为1 122.71 bp。与对照组相比,高温胁迫组共获得14 009个差异表达基因,其中5 543个差异表达基因上调,8 466个差异表达基因下调;低温胁迫组共获得20 030个差异基因,14 016个差异表达基因上调,6 014个差异表达基因下调。差异表达基因经KEGG数据库富集发现,高/低温胁迫均导致大海马体内抗氧化途径相关基因表达(HSP70、HSP90、SOD等)发生显著改变;另外,高温胁迫还造成大海马免疫系统相关基因(PIK3R、Akt、IL-10、TLR等)以及细胞凋亡相关基因(CYCS、CASP9、CASP3等)表达显著改变;低温胁迫造成DNA损伤修复(MSH、DDB2、XRCC2、RAD52、Ogg1、PMS2等)、脂肪酸代谢(StARD7、ApoA4、CYP51、Fadsd6等)和细胞凋亡(P21、P53、BAX等)相关基因显著上调。选择HSP70、Fadsd 6与IL-10等13个差异基因验证,RT-qPCR结果与RNA-Seq测序结果基本一致。本研究结果为深入探究大海马温度应激的调控机制奠定了一定的理论基础,而且有助于预防极端温度对大海马造成损伤。     

竹类植物中CYP85A1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯(BRs)是一种促进植物茎秆伸长的甾类植物激素,CYP85A1基因参与了BRs合成中重要的催化反应步骤。为阐明CYP85A1基因在竹类植物节间伸长中的作用,本研究以20个竹类植物为试验材料,利用生物信息学分析了CYP85A1基因的特点,并利用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在孝顺竹及其变种凤尾竹的不同组织和不同发育阶段的相对表达量。结果表明, 20个竹种中CYP85A1基因序列在DNA水平上的同源性为92.23%,cDNA序列的同源性为98.79%,氨基酸序列的同源性为97.86%;这些基因均含有9个外显子和8个内含子,编码465~480个氨基酸,蛋白分子量约为54 kDa,理论等电点均约为9.2。氨基酸序列中均含有细胞色素P450家族保守的血红素结合域、富含脯氨酸和氧的结构域及Glu-X-X-Arg结构域;CYP85A1基因孝顺竹和凤尾竹母竹的叶中表达量均最高,茎中次之,在根中的表达量最低。孝顺竹和凤尾竹幼竹中,该基因在顶部的表达量明显高于第2、第4、第5节间中的表达量;CYP85A1基因在快速伸长阶段的表达量明显高于生长缓慢时期,节间伸长速率越快该基因的表达量越高。综上,CYP85A1基因在竹类植物茎秆及节间伸长发育过程中具有促进作用。本研究结果为阐明CYP85A1在竹类植物中的生物学功能奠定了一定的理论基础。     

春兰与大花蕙兰杂交种红花呈色机理初探

为探究兰属杂交种红花的呈色机理,选择绿花春兰和黄花大花蕙兰的红花杂交种黄金梅为试验材料,通过小花蕾期和始花期花瓣的转录组测序分析,筛选影响花色的关键结构基因及调节基因,实时荧光定量PCR(qPCR)验证基因的差异表达,分光光度计法检测花瓣色素(类黄酮、叶绿素A、叶绿素B、花青苷)的含量。结果表明,通过测序共获得113 780条单基因(Unigene),其中200~300 bp的Unigene占比42.68%;44 088 个Unigene获得注释信息;与小花蕾期花瓣比较,始花期花瓣上调基因有1 855个,下调基因有2 494 个;差异表达基因(DEGs)被GO数据库注释划分为47个功能组;1 219个DEGs被KEGG数据库注释,涉及166条代谢途径;根据KEGG代谢通路及基因注释结果,筛选出与花色相关的54个关键结构基因和21个转录因子;花青苷合成基因DFR、ANS、3,5GT及转录因子Zm1、Hv1、MYB305表达量在始花期上调, 在NCBI库BLAST同源基因发现黄金梅DFR、ANS、3GT基因与大花蕙兰的基因同源性最高,5,3GT、3,5GT、Zm1基因与蝴蝶兰和石斛兰的基因同源性最高,转录因子Hv1、MYB305与建兰的基因同源性最高。qPCR参试基因表达量变化与转录组测序结果趋势一致。各阶段花瓣总黄酮的含量显著高于类胡萝卜素和叶绿素含量;始花期花瓣中花青苷含量升高。本研究结果为兰属杂交种花色基因的功能分析提供了参考。     

扇脉杓兰实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选出扇脉杓兰实时荧光定量PCR(RT-qPCR)中最适内参基因,以扇脉杓兰幼根、茎、叶、唇瓣、种子为研究材料,利用RT-qPCR技术检测12个常见看家基因TIF3I1、CYP22、RPS4、UPL1、UBC2、TUBB3、RPL26B、RAN1、SAMDC、ACT3、PP2A3和EF1的表达情况,结合geNorm、NormFinder和 BestKeeper软件综合评价候选内参基因的稳定性;根据分析结果筛选出最佳内参基因和其组合,并通过2个目的基因SERK2和ASK1对内参基因的稳定性进行验证。结果表明,在9个样品材料中,稳定性最好的内参基因为CYP22、UBC2、TUBB3、RPS4;在扇脉杓兰幼根、茎、叶和唇瓣中,PP2A3、TIF3I1表达较为稳定,SAMDC和ACT3最不稳定;TUBB3和UBC2在种子中表达稳定性最佳,RAN1和ACT3稳定性最低。相对稳定的内参基因TUBB3、UBC2、TUBB3+UBC2对目的基因SERK2和ASK1显示出一致的相对表达量;而不稳定的内参基因ACT3并没有对数据进行有效的标椎化,结果存在明显偏差。本研究不仅有助于提高扇脉杓兰基因表达分析的准确性,也为其他杓兰属植物内参基因的筛选提供了理论依据。