松材线虫Hsp70基因的克隆与原核表达

 热激蛋白70(Hsp70)是已知热休克蛋白家族中最重要的-种, 它在细胞内的大量表达可以明显改善细胞的生存能力, 提高对环境胁迫或伤害的耐受性。采用RACE-PCR技术, 从松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)中克隆了Hsp70基因的全长cDNA序列(共2 061 bp)(GenBank登录号为:DQ785812)。其编码-个分子量为70 kD的642个氨基酸的蛋白序列, 含有3段Hsp70家族的签名序列。同源性分析表明, 氨基酸序列与其它真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性, 并与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)热激蛋白70家族中的hsp-1基因编码的氨基酸序列更为相似。因此, 将克隆的松材线虫Hsp70基因命名为Bx-hsp-1。构建了-个原核表达载体Bx70pEASY-E1, 当IPTG终浓度为0.4~0.8 mmol/L时, 能诱导表达融合蛋白。Bx-hsp-1基因的克隆和表达, 将为松材线虫的生态适应性机理研究奠定基础。     

松材线虫mapk基因克隆及RNAi效应分析

促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase)在线虫生长发育过程中具有重要作用。本研究利用RACE方法克隆了松材线虫mapk基因,其基因全长1 744 bp,5'UTR长243 bp,3'UTR长81 bp,含有一个1 098 bp的开放读码框,包括6个外显子和5个内含子,为单拷贝基因,其预测的蛋白序列与其他线虫的序列相似性为77.66%~84.01%。通过体外转录合成341 bp的dsRNA,将松材线虫的幼虫浸泡在1.5 mg·mL-1dsRNA中24 h后,mapk表达量下降约85%,松材线虫的死亡率约为对照的4.2倍,经dsRNA浸泡的成虫,繁殖能力下降约50%,表明mapk基因的沉默可能抑制松材线虫的繁殖能力。     

利用RAPD研究松材线虫和拟松材线虫亲缘关系

 用RAPD技术对18个松材线虫株系、8个拟松材线虫株系基因组DNA多态性进行研究。在事先优化的条件下,用15个随机引物进行PCR扩增,一共扩增出165条谱带,多态性为91.5%。通过聚类分析,结果表明:松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的差异性,但种间差异大于种内差异,因而松材线虫和拟松材线虫应为2个独立的种。     

松材线虫rNDA-ITS1区分子检测与鉴定

利用两对松材线虫特异性引物，分别对来自日本、美国和葡萄牙的松材线虫虫样进行PCR检测，成功扩增出330bp和220bprDNA-ITS1区基因片段，该方法对松材线虫成虫或幼虫均能作出准确鉴定。     

口岸截获的日本松材线虫和中国南京松材线虫研究（摘要）

口岸截获的日本松材线虫和中国南京松材线虫研究（摘要）焦国尧沈培垠徐培方安榆林李红梅付鹏（南京动植物检疫局２１０００９）（南京农业大学２１００９４）数十年来，由松材线虫（Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）引起的松树萎蔫病在日本普遍发...     

南方根结线虫Col基因分子克隆及其VIGS效应分析

为了明确线虫角质层胶原蛋白基因(Col)与根结线虫病害的关系,利用从线虫基因组中预测的Col设计特异引物,克隆了南方根结线虫Meloidogyne incognitacol基因MiCol.该基因完整编码区长903bp,编码300个氨基酸.克隆的MiCol与预测的MiCol基因序列一致性高达99.67％,氨基酸序列一致性高达100％.利用病毒介导的基因沉默技术,将其导入番茄植株并接种南方根结线虫,60 d后,沉默载体pTV-MiColi处理番茄植株的根结数比空载体对照及清水对照分别减少49.4％和49.2％,表明MiCol基因沉默显著降低了南方根结线虫的侵染数量.     

Bxy-egl-30调控松材线虫早期个体发育的生物学功能研究

“发育快，交配效率高”是松材线虫种群扩张和病害流行的基础。通过生物信息学分析、原位杂交和RNAi等技术，本研究明确了Bxy-egl-30在松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)个体生长发育过程中的功能。生物信息学分析结果表明Bxy-egl-30编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸，属于EGL-30蛋白亚基家族。原位杂交结果显示Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段的表达具有特异性，在胚胎期与幼虫期该基因广泛表达于性腺、肠道和附近的体壁细胞等部位；在成虫期，该基因在雌虫的阴户肌肉和雄虫的性腺部位集中表达。RT-qPCR结果显示Bxy-egl-30在二龄期表达量最高，胚胎期次之，三龄期、四龄期和成虫期表达量依次降低。浸泡Bxy-egl-30双链RNA后，松材线虫胚胎的孵化率下降了10.88%,二龄期、三龄期幼虫活力明显下降，每分钟头摆频率约下降4次。致病性接种实验结果显示松材线虫被Bxy-egl-30双链RNA干扰后致病性减弱，减缓了黑松的死亡时间，干扰组黑松的死亡时间比对照组晚9 d。本研究明确了Bxy-egl-30基因在松材线虫不同发育阶段...     

松材线虫rDNA-ITS1区分子检测与鉴定

利用两对松材线虫特异性引物,分别对来自日本、美国和葡萄牙的松材线虫虫样进行PCR检测,成功扩增出330 bp和220 bp rDNA-ITS1区基因片段,该方法对松材线虫成虫或幼虫均能作出准确鉴定.     

线虫分离器的改进和松材线虫分离特点

对发现松材线虫和另一种伞滑刃线虫的两个木样 ,采用薄木片 (3 0 ) g进行线虫分离 ,线虫逸出有两个高峰期 ,分别是木样浸泡后第 8～ 1 1h和第 1 4～ 1 5h。所设计的分离器结合浅盘法和贝尔曼漏斗法分离线虫的优点 ,可用于线虫的定性分析和定量分析。木包装自身含水量低 ,线虫逸出高峰出现相对较早。     

日本松材线虫和南京松材线虫对雪松和马尾松的致病性研究

用来自日本的木质包装材料上截获的松材线虫和南京松材线虫进行对雪松Ｃｅｄｒｕｓｄｅｏｄａｒａ和马尾松Ｐｉｎｕｓｍａｓｏｎｉａｎａ的致病力试验，发现日本松材线虫能使４～５年生雪松苗２０％发病，１０％左右枯死，而南京松材线虫则没有致病力；１０年生雪松对两种松材线虫具有高度抗性。这两种松材线虫都能使马尾松中度感病和１０％左右的枯死     

异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制初步研究

对异硫氰酸丙烯酯毒杀松材线虫作用机制进行了初步研究。测定了其对线虫虫体形态、运动行为、体内总糖和蛋白质含量的影响,以及处理前后线虫体内过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性变化。结果表明:经异硫氰酸丙烯酯处理后的松材线虫虫体形态严重扭曲,运动形态出现由正常的S形变化为多节弯曲和螺旋状卷曲等异常状况,线虫行动随时间的推移变得迟缓,最终呈C形、新月形或直接死亡。随着异硫氰酸丙烯酯处理质量浓度的增大,线虫体内总糖和蛋白质含量显著上升,糖和蛋白质的代谢发生紊乱;线虫体内CAT、AChE和GST活性显著降低,且均低于对照组,表明线虫体内氧化和抗氧化作用失衡;细胞受到极大的影响,神经系统遭到破坏,解毒能力明显降低。研究结果可为研究利用异硫氰酸丙烯酯作为植物源杀线虫剂提供依据。     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。     

一种雌虫具尾尖突松材线虫的鉴定

为明确从辽宁省枯死红松病木中分离到的一种雌虫具明显尾尖突线虫群体的分类地位,采用改良漏斗法分离样品中的线虫并进行形态学鉴定,通过灰葡萄孢Botrytis cinerea人工培养观察雌虫尾尖突的形态变化,并基于rDNA 28S和ITS基因序列分析对其进行分子生物学鉴定。结果显示,经形态学鉴定初步判定该线虫群体为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus,具有典型的雄虫交合刺和雌虫阴门盖,但雌虫尾末端宽圆且无尾尖突的个体极少,只有2%～3%,其余雌虫个体尾末端有长约1.8μm(0.2～3.2μm)的尾尖突。但经人工培养产生的后代雌虫尾端均钝圆,无尾尖突。结合形态学和分子生物学鉴定结果,最终确定该线虫群体为松材线虫R型株系。松材线虫雌虫具有明显尾尖突的现象虽较为罕见,但仍会影响松材线虫的准确鉴定,需引起林业部门和口岸植物检疫部门的高度关注。     

高效新型杀松材线虫剂的筛选及其林间防效

为筛选出新型的高效松材线虫Bursaphelenchus xylophilus防治药剂,采用浸渍法室内测定了氯氟氰虫酰胺、阿维菌素、甲维盐、灭多威、特丁硫磷、甲基异柳磷和吡虫啉7种药剂对松材线虫的毒杀作用和对其繁殖能力的影响,采用高效液相色谱仪测定氯氟氰虫酰胺在马尾松体内的输导分布,并在林间开展树干注射氯氟氰虫酰胺抗松材线虫病试验。结果表明,7种药剂中氯氟氰虫酰胺对松材线虫的毒力最强,LC_(50)为0.019 mg/L,阿维菌素和甲维盐次之,LC_(50)分别为0.0213 mg/L和0.0214 mg/L。氯氟氰虫酰胺树干注射3个月内能迅速从马尾松基部传导至树梢顶部,树干边材东、南面的药剂含量显著高于西、北面,且树干不同高度的氯氟氰虫酰胺含量均高于其LC50;氯氟氰虫酰胺制剂在林间注干后,对人工接种病原松材线虫松树的防治效果为73.33%,自然感染松材线虫病松树的死亡率降至2.00%,而对照试验中人工接种松材线虫松树和自然感染松材线虫病松树的死亡率分别为93.33%和19.67%。表明氯氟氰虫酰胺制剂能有效预防松树个体的松材线虫病发生与为害,可以推广使用。     

两种分子技术检测松木中松材线虫的效果评价

为更好地解决当前松材线虫Bursaphelenchus xylophilus检测工作中频现的假阴性问题,通过不同分子技术检测效果的比较评价,摸索出了一套可提高松材线虫检测准确性的技术体系。针对早期感病松木的低线虫量,建立了线虫的最大量分离方法和基于rDNA ITS序列的分子检测体系,该体系可高效检测出单条松材线虫,准确率达93.75%。以来自浙江省不同疫区的96份松木样品为检测材料,比较了SCAR标记和ITS序列2种分子检测技术的阳性率。结果显示,通过首次PCR,ITS_Ⅰ和ITS_Ⅱ序列的检测阳性率分别为52.08%和55.21%,SCAR标记的检测阳性率为30.21%;通过第二次或巢式PCR,ITS_Ⅰ和ITS_Ⅱ序列的检测阳性率提高到了97.92%和100.00%,SCAR标记的检测阳性率提高到了59.38%,表明基于ITS序列的检测阳性率明显高于SCAR标记,且通过第二次或巢式PCR方法可进一步提高检测灵敏度,降低假阴性率。因此,通过线虫的最大量分离并基于rDNA ITS序列的分子检测可明显提高检测准确性,更适用于松材线虫的常规检测。     

鱼藤酮水基纳米悬浮剂的特性及对松材线虫的杀虫作用

为改善鱼藤酮制剂的分散性,提高其悬浮率、稳定性及生物活性,制备了鱼藤酮纳米悬浮剂。该剂型为水基剂型,环境扫描电子显微镜和高效液相色谱检测结果显示,在鱼藤酮的水基纳米悬浮剂中,鱼藤酮悬浮颗粒的平均粒径为127.1 nm±31.8 nm,鱼藤酮的包封率为81.7%±3.5%,该制剂悬浮率高达99.23%±0.49%,抗光照分解的稳定性增强,36 h紫外光照射后鱼藤酮纳米悬浮剂中残存的鱼藤酮浓度比鱼藤酮丙酮溶液提高68.9%。以LC50表示的24 h对松材线虫的毒力鱼藤酮纳米悬浮剂是鱼藤酮丙酮溶液的7.5倍。     

三株芽胞杆菌菌株对松材线虫低温存活与繁殖的影响

为明确细菌在松材线虫生态适应性中的作用,本研究选择与致病相关的松材线虫伴生细菌GD1、马尾松内生细菌GD2以及具有杀松材线虫活性的湿地松内生细菌NJSZ-13为试验对象,测定经这3株芽胞杆菌菌株3个浓度低温驯化10、15和20 d后,在冷冻条件下松材线虫强毒虫株AMA3、中毒虫株AA3和弱毒虫株YW4的存活率和繁殖量。结果表明:低温驯化15 d和20 d后3株菌株对不同毒力线虫的活力影响较驯化10 d后的更显著。在低温驯化15 d、-20℃冷冻处理1 h后,5×10⁶CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的存活率分别为77.22%、83.68%和84.26%,与对照差异显著;5×10⁵CFU/mL浓度菌株GD1处理下,虫株AMA3、AA3和YW4的存活率分别为75.76%、80.67%和81.50%,与对照差异显著。5×10⁶CFU/mL和5×10⁵CFU/mL浓度菌株GD2处理下,与GD1处理组结果相似,菌株NJSZ-13处理组则与菌株GD1和GD2的结果相反。低温驯化15...