二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

郁金香SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。     

桉树SSR-PCR体系优化及引物筛选应用

以尾叶桉、细叶桉、粗皮桉为材料,采用L16(45)正交设计对SSR-PCR反应体系中的引物浓度、DNA浓度、Mg2+浓度、d NTP浓度和Taq酶含量5种因素的4个水平进行优化实验,确立了适合细叶桉、粗皮桉、尾叶桉SSR-PCR最佳反应体系,最终优化的SSR-PCR反应体系为:0.25μmol/L引物、5 ng模板DNA、3.75 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L d NTP、1.5 U Taq酶、1 m L 10×PCR Buffer,双蒸水补齐10μL;并利用优化的体系从74对SSR引物中筛选出12对多态性较高的引物,12对引物在3种桉树中均能扩增出条带,在尾叶桉、细叶桉、粗皮桉中的多态率分别为100%、92.86%、64.29%,为尾叶桉、细叶桉、粗皮桉的遗传多样性分析、品种鉴定、亲缘关系分析等提供了分子技术基础。     

月季SSR-PCR反应体系的建立和优化

采用L16(54)正交设计和二因素完全随机试验,分析了月季SSR-PCR反应体系的主要成分Taq DNA聚合酶、样本浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度以及引物浓度对扩增结果的影响,建立了适合月季的SSR反应体系.研究结果表明:在20μL反应体系中,Taq DNA聚合酶宜加入1.5U,样本最适宜浓度为30～40 ng,Mg2+的最适浓度为1～1.5 mmol/L,dNTP最适浓度为0.2 mmol/L,单引物的最适浓度均为1μmol/L.用建成的反应体系对19对引物筛选,对12个月季品种扩增,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,品种间DNA谱带多态性丰富,证明该体系稳定可靠.     

凤仙花属植物SSR-PCR反应体系的建立与优化

SSR-PCR反应体系的建立与优化是凤仙花属植物(Impatiens L.) SSR标记研究的基础,本研究以8种凤仙花属植物为试材,对Mg~(2+)、Taq酶、dNTPs浓度、DNA模板、引物浓度等5因素进行L_(16)(4~5)正交试验,探讨适合凤仙花属植物的SSR-PCR反应体系,并对主要因素进行优化。结果表明:Mg~(2+)、Taq酶和dNTPs浓度3个因素对凤仙花属SSR-PCR扩增结果有显著影响,影响程度为Mg2+Taq酶dNTPs浓度DNA模板引物浓度;20μL为最佳反应体系,其中,2.6 mmol/L (含10×PCR Buffer)的Mg~(2+),1.6 mmol/L的dNTPs,2μmol/L的引物,60 ng的DNA,0.1 U的Taq酶,ddH_2O补齐剩余部分。利用优化后的反应体系对同属54种材料进行PCR扩增,扩增产物在130～200 bp,具4个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系的建立可为今后利用SSR标记对凤仙花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

棉花SSR-PCR反应体系的优化

为探索适宜棉花的SSR-PCR反应体系,采用L9(34)正交实验设计,研究了棉花SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响.试验结果表明,棉花SSR-PCR最适反应体系为:在20 μL反应体系中,TaqDNA聚合酶用量为1 U、dNTP浓度0.2 mmol/L、引物浓度0.6 μmol/L、Mg2 浓度1.0 mmol/L和模板DNA50 ng;引物退火温度为55℃～58℃.利用六种棉花材料和10条不同引物验证此反应体系,8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,扩增结果在100～300 bp,反应体系的稳定性和可重复性较好.     

硬叶兜兰叶绿体DNA SSR反应体系的优化及引物筛选

本研究以硬叶兜兰为试验材料,通过改良的CTAB法提取总DNA,运用5因素4水平的正交试验设计,综合采用直观量化分析和方差分析两种方法,分析模板DNA用量、Mg2+浓度、d NTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量五个因素对cp SSR-PCR扩增的影响,比较不同组合扩增效果的差异,最终确定优化的硬叶兜兰cp SSR-PCR反应体系;并通过梯度PCR确定最佳退火温度。研究结果表明,以DNA模板用量对扩增反应的影响最大,Mg2+浓度的影响最小;较优的反应体系为:模板DNA 45 ng、d NTPs 0.2 mmol/L、引物各0.6μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.4 U、10×PCR-Buffer,总体积10.0μL。本研究采用该体系对采自滇东南7个居群的12份样本扩增验证其稳定性,并从33对引物中筛选出扩增条带清晰、具明显等位基因、特异性好的12对引物。研究结果说明该优化体系能较好地对硬叶兜兰居群个体遗传差异进行分析。     

番茄叶片DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了进一步开发利用番茄种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用高通量组织研磨机研磨微量叶片,通过改良CTAB法快速提取DNA,并利用L16(45)正交设计试验,综合采用直观量化分析和方差分析两种方法,分析Mg2+、d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA浓度5个因素对番茄SSR-PCR扩增的影响,比较不同处理组合扩增效果的差异,最终筛选与验证最优的番茄SSR-PCR反应体系,并在此体系下对SSR引物进行筛选。结果表明番茄SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为Mg2+3.0 mmol/L、d NTPs 0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、引物0.5μmol/L、模板DNA 40 ng;且利用优化后的反应体系,从540对SSR引物中筛选出373对(占69.07%)扩增条带清晰、多态性丰富的引物。该SSR-PCR体系的建立为番茄种质资源遗传多样性分析,品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。结果表明各因素的终浓度分别在Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4 μmol/L及退火温度为53.9℃时最为适合。通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。     

新疆野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立适合新疆野生欧洲李的ISSR-PCR反应体系,本研究以野生欧洲李为供试材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计和单因素试验设计相结合的方法,对影响野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的5个因素(DNA模板,Taq酶,dNTPs,引物,Mg²⁺)进行筛选与优化,对16条引物的退火温度进行筛选。结果表明,Taq酶对PCR扩增反应的影响最大,野生欧洲李ISSR-PCR最佳反应体系为:总体积20μL,5 U Taq酶0.10μL,10 mmol/L引物1.00μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.50μL,10×Buffer(含Mg²⁺)2.00μL,50 ng/μL DNA模板1.00μL,双蒸水14.40μL。建立的ISSR-PCR反应体系经过22份野生欧洲李样品验证,表明反应体系稳定可靠,可用于后续遗传多样性研究,为野生欧洲李种质资源的保护和利用提供理论参考。     

蓝莓SCoT标记分析体系的建立与优化

为建立蓝莓SCoT标记分析体系,为蓝莓的分子育种和遗传多样性分析等研究提供技术支持,以蓝莓叶片为试材,采用L16(45)正交设计方法,对影响蓝莓SCoT-PCR反应的Mg²⁺、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板DNA及引物等因素进行优化筛选,建立了适用于蓝莓遗传分析的SCoT-PCR扩增体系,即20μL的反应体系中含有：Mg²⁺为2.813 mmol/L、dNTPs为0.100 mmol/L、Taq酶为1.5 U、Primer为0.2μmol/L、DNA为10 ng。应用优化的反应体系,对32个SCoT引物和6个蓝莓品种‘( Centurion’、‘Premier’、‘Homebell’、‘O'Neal’、‘Tifblue’、‘Misty’)进行扩增,获得了条带清晰、稳定可靠的电泳结果。     

西番莲科龙珠果ISSR-PCR体系的建立和优化

为了获得适于龙珠果ISSR-PCR的反应体系,本研究以龙珠果叶片为试验材料,提取基因组DNA,采用L16(45)正交设计试验,对影响龙珠果ISSR-PCR扩增结果的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和模板DNA量进行优化,并筛选了最适退火温度。试验结果分析表明,各因素影响显著性为dNTPs浓度>Taq DNA聚合酶用量>Mg²⁺浓度>模板DNA量>引物浓度。在20μL反应体系中,dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、Mg²⁺浓度2.0 mmol/L、模板DNA 25 ng、引物浓度0.4μmol/L为最佳用量。实验从100条UBC引物中筛选得到22条多态性较好的引物。本研究为龙珠果ISSR标记开发、种质资源鉴定、遗传多样性分析和分子标记辅助选择育种等提供科学依据。     

甜菜TRAP-PCR反应体系的建立及引物开发策略

以糖用甜菜为材料,利用单因素实验探讨甜菜TRAP-PCR反应体系中dNTPs、引物、模板以及DNA聚合酶等4个因素的浓度变化对扩增结果的影响,最终建立糖用甜菜的最佳TRAP-PCR反应体系。结果表明,在20 μL反应体系中,甜菜TRAP-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg²⁺）、10 ng的模板DNA、0.75 U的Taqase、10 μmol/L固定引物及随机引物各0.8 μL以及0.5 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。并建立了一种快速开发甜菜TRAP-PCR引物的方法,利用优化后的程序对15份糖甜菜品种进行扩增。结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,部分引物多态性丰富,可用于糖用甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。     

刺槐EST-SSR标记PCR反应体系的优化

为建立一套适用于刺槐EST-SSR标记的PCR反应体系,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计结合单因素试验,对刺槐EST-SSR PCR反应体系中的5个主要因素：引物、DNA模板、dNTPs、Mg²⁺和Taq DNA聚合酶进行优化试验。结果表明：在20μL反应体系中,各反应因素的最佳水平为0.5μmol/L引物、30 ng模板DNA、0.15 mmol/L dNTP、0.5 mmol/L Mg²⁺、1.0 U Taq DNA聚合酶。利用随机挑选的3个刺槐优良无性系品种和7对EST-SSR引物对优化体系进行验证,结果均能获得稳定、清晰的条带,证明该体系稳定可靠。此优化体系的建立为刺槐EST-SSR标记的开发以及利用EST-SSR标记深入研究和利用中国刺槐种质资源奠定基础。     

茶花品种SSR指纹图谱分型技术反应体系优化

建立茶花品种分子指纹图谱对茶花品种鉴别、品种选育和深入实施品种产权保护等具有重要意义。为筛选适用于茶花品种SSR指纹图谱构建的引物及其最优反应体系,采用梯度退火温度和正交试验设计的方法,对4对SSR引物反应条件进行了研究。结果表明,2对引物扩增出目的条带,其中引物MSCjaF25最适退火温度52.9℃,10 mL体系中各组分含量为Mg²⁺ 1.2 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、引物0.2 mmol/L以及模板DNA 40 ng时图谱质量最优;引物MSCjaF37最适退火温度58.2℃,10 mL体系中各组分含量为Mg²⁺ 0.8 mmol/L、dNTPs 0.1 mmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、引物0.3 mmol/L以及模板DNA 40 ng时,图谱质量最优。以12个茶花品种进行扩大试验证明,优化的体系重复性和稳定性良好。研究为茶花品种分子指纹图谱的构建奠定重要基础。进一步分析显示,全面开展茶花品种分子指纹图谱研究还面临着筛选更多通用SSR引物的挑战。     

番石榴SRAP反应体系的建立与正交优化

采用正交设计方法,对影响番石榴SRAP反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA浓度等进行了优化,建立了适用于番石榴的SRAP反应体系。该优化的20 μL反应体系中包含2.5 mmol/L Mg2+,0.15 mmol/L dNTPs,0.4 μmol/L引物,1.5 U Taq DNA聚合酶和20 ng模板DNA。利用该优化体系通过64对SRAP引物组合对5份番石榴材料进行了SRAP-PCR扩增,结果表明SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于番石榴种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究。     

白蜡属SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究建立了适合白蜡SSR-PCR反应的最佳体系,并利用该体系从50对白蜡引物中筛选出了3对条带清晰、多态性好的引物,用于白蜡SSR标记的进一步研究。该研究采用L₁₆(4⁵正交设计和单因素试验对影响白蜡SSR-PCR的Taq聚合酶用量、Mg²⁺浓度、DNA模板浓度、dNTP浓度和引物浓度等5个因素在4水平上进行筛选。优化后的白蜡SSR反应体系为：Mg²⁺ (25 mmol/L) 0.8μL、引物(10μmol/L) 0.2μL、DNTP (10 mmol/L) 0.3μL、Taq酶(5 U/μL) 0.05μL、DNA模板(5~10 ng/μL) 2.00μL、10×PCR缓冲液1.0μL,ddH2O 5.45μL,总体积10.0μL。该结果为今后利用SSR-PCR标记技术研究分析白蜡奠定了基础。