拟南芥TUA2参与ABA胁迫下的种子萌发过程

【目的】利用反向遗传学研究拟南芥TUA2与ABA途径相关基因的相互关系以及对种子萌发的影响。【方法】采用PCR、Tail PCR和RT-PCR技术对来自ABRC的T-DNA插入TUA2突变体进行插入位点的鉴定和转录活性的分析;利用转基因技术获得TUA2超表达植株;检测了含不同浓度ABA的MS培养基中各突变体和TUA2超表达植株的种子萌发;通过RT-PCR检测了突变体中ABA途径相关基因HAB、ABI1、RD22和P5CS的表达变化。【结果】突变体tua2-1和tua2-2的T-DNA插入位点均位于TUA2的启动子区,且二者的TUA2表达量均升高。在含有ABA（0.8 μmol•L-1）的MS培养基中,突变体和转基因等5个株系的种子萌发延迟,播种第5天萌发率在6%-18%,相同条件下的野生型种子萌发率为76%;ABI1和HAB在TUA2超表达体中的表达明显低于野生型,受ABA诱导后被诱导表达的程度也远低于野生型。【结论】TUA2可能参与了ABA信号途径对种子萌发过程的调节。     

拟南芥ABI3基因缺失突变体的鉴定及对盐胁迫的响应

采用PCR和RT-PCR技术分别在DNA和RNA水平上对由于T-DNA插入所导致的拟南芥ABI3基因突变体进行鉴定,鉴定后将野生型Col-0与纯合abi3突变体种子分别置于含不同浓度NaCl的MS培养基上培养,测定萌发率、生物量和根长。结果表明:在NaCl胁迫下,野生型Col-0和纯合abi3突变体种子的萌发率、生物量和根长均随着NaCl浓度的增加呈现下降趋势。在相同NaCl浓度下,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均低于野生型Col-0。当NaCl浓度达到150 mmol/L时,纯合abi3突变体种子的萌芽率、生物量和根长均降到最低,与野生型Col-0存在极显著差异。可见,拟南芥ABI3基因具有提高拟南芥抗NaCl胁迫能力的作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5＇非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1 b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPaseRABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

AtMYB73基因正调控拟南芥对盐胁迫的响应

为明确拟南芥R2R3-MYB转录因子家族第22亚族基因AtMYB73在拟南芥抵抗盐胁迫过程中的功能,本研究将拟南芥野生型Col-0、AtMYB73基因的T-DNA插入突变体myb73和超表达突变体OE进行NaCl胁迫处理,检测突变体在NaCl胁迫下的种子萌发率、存活率及抗盐相关基因的表达情况。结果发现,在NaCl胁迫下,myb73突变体的种子萌发率、幼苗的存活率、成株时期的存活率及拟南芥抗盐相关基因MYB44、SOS2和SOS3的表达均明显低于野生型和超表达突变体,表明AtMYB73基因正调控拟南芥对盐胁迫的响应。     

拟南芥隐花色素在脱落酸调节种子萌发中的功能

隐花色素(Cryptochrome,CRY)在植物中介导蓝光信号传导,调节生长发育的多种过程。脱落酸(Abscisic acid,ABA)在种子萌发和幼苗发育中发挥重要作用。研究发现一些高等植物的CRY调节逆境中种子的萌发,但关于拟南芥CRY1在这一过程中发挥的作用及其机制尚不清楚。试验对拟南芥隐花色素CRY1功能缺失突变体和CRY1CRY2功能缺失双突变体种子萌发对脱落酸的响应进行了研究,利用荧光定量PCR技术检测脱落酸信号传导基因和代谢关键酶基因在cry1突变体中表达量的变化,结果显示CRY1负向调节脱落酸抑制的种子萌发,而且CRY1和CRY2在这一过程中发挥相反的作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明,T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5′非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPase RABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

苯丙氨酸处理对拟南芥酪氨酸降解途径的影响

以拟南芥野生型Col–0(CK)和酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1为试验材料,观察统计了4种浓度(0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)苯丙氨酸处理下种子萌发和幼苗生长情况,分析了苯丙氨酸对酪氨酸降解途径中关键基因HGO、MAAI和SSCD1表达的影响。结果发现:0.5、1.0、2.0 mmol/L苯丙氨酸处理能够抑制拟南芥种子的萌发和根的生长,对突变体sscd1的抑制程度高于野生型对照;0.1、0.5 mmol/L苯丙氨酸促进幼苗地上部分的生长,1.0、2.0 mmol/L苯丙氨酸抑制地上部生长,其中对突变体sscd1的抑制作用更为显著;q RT–PCR分析发现,苯丙氨酸处理能显著上调野生型中HGO基因的表达以及酪氨酸降解途径缺陷突变体sscd1中HGO和MAAI基因的表达,表明苯丙氨酸能上调拟南芥酪氨酸降解途径。     

基于ARF10转录因子功能验证及其对拟南芥种子休眠和萌发的影响

生长素是一种新的调控种子休眠的激素,ARF10作为生长素信号途径下游的一个转录因子也参与其中,然而其调控的分子机制并不清楚。以拟南芥茎生叶为供试材料,克隆获得编码ARF10转录因子的基因片段,利用DNA重组技术构建ARF10过量表达载体35S::ARF10-pCAMBIA1301,并通过浸花法转化野生型拟南芥,获得ARF10过量表达的转基因植株(ARF10-OE),通过检测种子休眠性和对ABA敏感性,探究其对种子休眠与萌发的影响。结果显示,ARF10种子休眠性显著高于野生型,其ABA敏感性也较对照更高。基因表达分析结果显示,ARF10基因过量表达能够明显增强调控种子休眠和萌发的关键基因ABI3、ABI4、ABI5以及NCED9的表达,生长素信号途径下游末端转录因子ARF10可能通过上调ABI3、ABI4、ABI5基因的表达,提高了种子对ABA的敏感性;通过上调NCED9的表达,增强了种子的休眠性。     

ABA在拟南芥种子萌发和幼苗发育中的作用

采用不用浓度ABA处理各种基因型的拟南芥种子,结果表明:拟南芥abi1和abi2是ABA信号的负调节者;异三聚体G蛋白α亚基gpa1基因超表达株系和T-DNA插入突变体在种子萌发和幼苗发育中对ABA不敏感;相对于野生型来说,a/c、a/g表现出相对的ABA不敏感性,表明在ABA抑制的种子萌发和幼苗发育过程中gap1可能位于abi1上游。     

镧和低pH值对拟南芥种子萌发和主根生长的影响

[目的]研究La^3＋和pH值对拟南芥种子萌发和主根生长的影响,优化拟南芥抗La^3＋突变体的筛选条件。[方法]通过人工控制pH值研究低pH值和La^3＋对拟南芥种子萌发及主根生长的影响。[结果]拟南芥种子萌发的适宜pH值范围较宽,但过低pH值会推迟种子发芽,降低种子萌发率。随着酸度的增加,主根生长受到抑制。pH=5．5时,拟南芥种子萌发和主根生长受到的影响较小。La^3＋浓度为5mg／kg及以下时刺激种子萌发,为10mg／kg及以上时推迟种子萌发,为1mg／kg时刺激主根生长,为5mg／kg及以上时显著抑制主根生长。随着La^3＋浓度的增加,种子萌发和主根生长受到的抑制作用增强。在去P培养基与纯La培养基中,拟南芥种子萌发和主根生长对La^3＋的反应趋势基本相同。[结论]过低pH值和不低于5mg／kg的La^3＋浓度对拟南芥种子萌发和主根生长有负面影响。     

过表达玉米ZmSC1基因增强转基因拟南芥的耐盐性

旨在从玉米中克隆耐盐相关基因ZmSC1,分析其分子特征并在拟南芥中研究其耐盐性的生物学功能。以玉米B73为试验材料,克隆ZmSC1全长序列,与其他物种进行同源性比对,解析其盐诱导表达模式和亚细胞定位情况,将ZmSC1转入到拟南芥突变体atsc和野生型中,观察在盐处理下种子萌发率和主根根长情况,利用荧光定量PCR分析相关逆境（140 mmol·L^-1胁迫）基因的表达量。结果表明,ZmSC1基因全长为423 bp,编码141个氨基酸,ZmSC1和小麦、拟南芥中已知的TaSC1、AtSC1具有较高保守性。烟草细胞瞬时表达、玉米原生质体亚细胞定位研究表明ZmSC1定位于细胞膜中。生物学功能研究发现在140 mmol·L^-1的NaCl的盐处理下,相比较于拟南芥突变体,回补植株拟南芥的种子萌发率和主根根长得到了明显改善,这说明ZmSC1基因可以回补拟南芥同源基因AtSC1突变体植株在盐胁迫下的表型。ZmSC1基因过表达拟南芥植株的种子萌发率和主根根长也显著高于野生型植株。荧光定量PCR结果显示相较于野生型,在过表达植株中AtRD29A、AtSOS2、AtSOS3、AtCDPK1等胁迫相关基因的表达量也明显增强。研究结果表明TaSC1、AtSC1的同源基因ZmSC1对提高拟南芥的耐盐性具有重要作用。     

小立碗藓PpCAD4基因敲除载体的构建及功能研究

木质素是植物抵御外界环境的重要成分,肉桂醇脱氢酶（cinnamic alcohol dehydrogenase,CAD）是木质素合成途径中的关键酶和限速酶之一。前期数据表明,在灰霉菌侵染下,PpCAD4基因上调表达,但PpCAD4功能尚未明确。本次研究利用同源重组原理构建PpCAD4.1-PTN182-PpCAD4.2敲除载体,从而破坏PpCAD4的alcohol dehydrogenase GroES-like domain（ADH_N）和zinc-binding dehydrogenase（ADH_zinc_N）结构域。利用PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选并鉴定得到敲除PpCAD4突变体植株。qRT-PCR表明,敲除型植株中PpCAD4的表达量相对野生型减少了84%。通过对配子体的形态观察发现,PpCAD4突变株通过增加配子体中拟叶的数量,使得植株生物量增加,这表明CAD4在早期陆生植物的生长发育中起着重要作用。用灰霉菌侵染小立碗藓发现,0.5 d后野生型配子体菌丝入侵率为15%, cad4-ko菌丝入侵率为40%。侵染1 d后,Ppcad4-ko配子体菌丝侵入率是野生型的2倍。表明PpCAD4能够增加小立碗藓对真菌病原菌的抗性。     

落叶型大丽轮枝菌脱落酸合成相关基因功能研究

为了探讨大丽轮枝菌中脱落酸（Absicisic acid,ABA）合成相关基因在致病过程中的功能,克隆大丽轮枝菌落叶型菌株XJ592的ABA合成相关基因Vdaba1、Vdaba2(1)、Vdaba2(2)和Vdaba4,采用同源重组的方法分别获得4个基因的敲除突变体菌株。生物学功能测定结果表明,Vdaba1主要参与促进大丽轮枝菌的产孢,Vdaba2(1)和Vdaba2(2)基因影响大丽轮枝菌的生长速率,Vdaba4基因参与调节大丽轮枝菌对氧化压力胁迫的响应。致病力测定结果表明,接种21 d时Vdaba1和Vdaba4基因突变体菌株的致病性显著低于野生型菌株XJ592,但在接种30 d时突变体与野生型XJ592接菌棉花植株的落叶率均为100%。     

转GhB301基因棉花抗枯萎病机理研究

为了明确棉花AP2/ERF转录因子基因GhB301在抗枯萎病中的功能,以过表达GhB301转基因棉花纯合株系（OE）与野生型对照YZ-1（WT）为材料接种枯萎病菌,研究接菌后不同棉花材料叶片中防御酶活性变化及抗病相关基因的表达差异。结果显示：接菌后0~7 d,随着接菌时间的延长,棉花叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性逐渐增高,均呈先增加后降低的变化趋势,但转基因株系中酶活性提高的更快、峰值更高;接种棉花枯萎病菌24 h后,测定各材料中苯丙烷代谢途径（GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT1、GhF5H2、GhCCR1）、JA/ET路径（ GhAOC1、 GhAOS1、GhEIN2、GhERF1、GhJAZ1）、SA路径（GhICS1、GhEDS1、GhPAD4、GhNPR1）、PR基因（GhPR1、GhPR2、GhPR4、GhPR5）等抗病相关基因的相对表达量,除GhERF1、GhJAZ1、GhNPR1外其余均在转基因株系中上调表达。推测在棉花中过表达GhB301基因提高了防御酶活性和抗性基因的表达,从而增强棉花对枯萎病的抗性。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

党参和黄芪根际土壤水浸液对亚麻种子萌发和幼苗生长的化感效应

为了探讨党参和黄芪根际土壤水浸液对亚麻的化感作用,采用生物测定方法,研究党参和黄芪根际土壤水浸液在0.5、0.25、0.125和0.062 5g·mL-1 4个质量浓度下对亚麻种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明,2种草药根际土壤水浸液对受体亚麻种子吸胀过程中相对吸水量的增加有抑制作用,抑制程度随其质量浓度的升高而增强;亚麻种子萌发和幼苗生长在低质量浓度时表现为化感促进作用,在高质量浓度时表现为化感抑制作用,对亚麻幼苗渗透调节物质可溶性糖、丙二醛(MDA)和游离脯氨酸(Pro)含量都有显著影响。     

拟南芥免疫相关基因启动子对免疫信号分子的响应强度分析

为对比不同的植物抗病相关基因对植物免疫激发子的响应强度,筛选出响应强度较高的报告基因,从拟南芥中克隆5个植物免疫相关基因(WRKY33、FRK1、WRKY29、PR2和PDF1.2)的启动子序列,构建目的基因启动子驱动的萤光素酶(Luciferase,LUC)表达载体,并将其转化到拟南芥原生质体中瞬时表达;经植物免疫激发子(FLG22与PEP1)处理后,进行LUC活性检测,判断目的基因启动子的激活情况,分析上述目的基因启动子对免疫信号分子的响应强度。结果显示:经FLG22与PEP1处理后,拟南芥原生质体细胞中WRKY33响应强度为最高,与对照相比分别上调11.2与4.5倍,WRKY29响应强度次之,分别为对照的10.0与3.1倍;与WRKY相比,FRK1响应强度明显降低,而PR2与PDF1.2均无明显响应。上述结果表明在拟南芥原生质体瞬时表达体系中WRKY33可高效响应植物免疫激发子,pWRKY33::LUC原生质体表达体系可作为一种高效的PTI反应报告系统,用于新型植物免疫激发子的筛选鉴定。     

NaCl胁迫对马唐种子萌发及幼苗生理特性的影响

旨在明确NaCl胁迫对马唐种子萌发及生理特性的影响,为直播稻田马唐适生区域的预测及综合治理提供参考。以马唐种子为材料,采用0、10、30、60、100、150和300 mmol·L^-1 NaCl溶液进行培养,测定马唐种子各萌发指标,并对幼苗生物量及马唐体内叶绿素含量（chlorophyll）、丙二醛含量（malondialde-hyde, MDA）、根系活力（root activity）、超氧化物歧化酶活力（superoxide dismutase, SOD）及过氧化物酶活力（peroxidase, POD）进行比较。结果显示：随着NaCl浓度升高,马唐种子萌发率、相对萌发率、萌发势、萌发指数及胚根和胚芽长度均呈持续下降趋势,而相对盐害率逐渐增强,浓度达300 mmol·L^-1时种子停止萌发;当NaCl浓度为60 mmol·L^-1时,马唐的胚根和胚芽长均达对照水平。马唐幼苗鲜质量随NaCl溶液浓度升高基本呈下降趋势,幼苗干质量较对照无明显差异（P < 0.05）。幼苗的叶绿素含量随NaCl浓度升高逐渐降低;当NaCl浓度为60 mmol·L^-1时,马唐根系活力、SOD活力与对照相比均增加;MDA含量受NaCl胁迫后较对照升高,在NaCl浓度为300 mmol·L^-1时较对照显著增加（P < 0.05）。研究结果显示马唐萌发对NaCl胁迫的适应范围较宽,幼苗具有较强的耐盐能力。     

蒺藜苜蓿生物钟基因MtTOC1a的克隆及功能验证

【目的】分析蒺藜苜蓿Medicago truncatula生物钟基因MtTOC1a的蛋白结构，探究MtTOC1a在生物钟系统中的生物学功能，比较其与拟南芥Arabidopsis thaliana的AtTOC1功能相似性和差异性。【方法】通过生物信息学分析，在全基因组范围内鉴定了TOC1在蒺藜苜蓿中的同源基因。构建MtTOC1a基因的表达载体，利用农杆菌介导法引入到拟南芥野生型Col、及相应的功能丧失突变体toc1-2中，进行遗传互补分析。【结果】Mt TOC1a和MtTOC1b均具有保守的功能结构域和三维结构。遗传分析表明，在早期光形态建成中，外源转化的MtTOC1a完全恢复了toc1-2的下胚轴伸长表型，但对toc1-2的提前开花表型没有显著影响。在引入CAB::LUC报告基因的株系中，外源转化MtTOC1a在连续光照下使短周期突变体toc1-2的近日节律周期延长，但仍不能完全恢复至野生型水平。【结论】MtTOC1a和拟南芥AtTOC1的功能存在相似性，但在不同的下游调控途径中所扮演的角色存在差异。本研究结果为进一步探索MtTOC1a基因的功能，利用MtTOC1a基因改造苜蓿的重要性...