三角帆蚌细胞周期蛋白基因筛选及其表达分析

细胞周期蛋白(cyclin)对细胞生长繁殖起到关键的调节作用。该研究采用高通量测序技术,构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)转录组文库,进行了cyclins基因筛选与生物信息分析,通过qRT-PCR技术,探讨其在不同组织(闭壳肌、内脏团、外套膜、斧足、心脏、血液、鳃、性腺)与性别中的表达特征。转录组测序共得到257 457条unigene(N50为1 796 bp),注释率为86.7%;通过分析,cyclin A、cyclin D2、cyclin E被筛选出,且cyclin A、cyclin D2与cyclin E蛋白的氨基酸序列均与美洲牡蛎(Crassostrea virginica)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)具有较高相似性。实时荧光定量分析结果表明,cyclin A、cyclin D2、cyclin E在三角帆蚌各组织中均有表达,且存在显著的组织差异:cyclin A、cyclin E基因在性腺中表达量显著高于其他组织(P<0.05),在斧足中表达量最低;cyclin D2基因在鳃中表达量最高(P<0.05),在血液中表达量最低。在同一组织的不同性别之间:cyclin A基因在性腺、闭壳肌、心脏、血液中表达存在显著性别差异(P<0.05);cyclin D2在外套膜、心脏、性腺中的表达具有显著(P<0.05)的性别差异;cyclin E在性腺、斧足、鳃、心脏中的表达具有显著(P<0.05)的性别差异;cyclin A、cyclin E基因在雌性心脏和性腺中表达量显著(P<0.05)高于雄性,而cyclin D2反之(P<0.05),cyclin D2基因在雌性外套膜表达量显著高于雄性(P<0.05),暗示cyclin A、cyclin E与性腺发育关系密切,cyclin D2可能与鳃损伤修复有关。本研究初步探究了三角帆蚌cyclin A、cyclin D2、cyclin E基因的功能,为建立三角帆蚌细胞系提供了分子基础。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用,通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp,开放阅读框（ORF）为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程,在腮、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示,WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号,推测WNT4基因与性别决定相关。     

三角帆蚌KLHL10基因的特征和表达分析

为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用,利用RACE （Rapid-amplification of cDNA ends）克隆了其cDNA全长,使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织（性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜）、早期发育阶段（1~8月龄）性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异,运用RNA干扰（RNAi）对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2 361 bp,其中5''非编码区长93 bp,3''非编码区长447 bp,开放阅读框（ORF区）长1 821 bp,编码606个氨基酸;qRT-PCR结果显示KLHL10基因在精巢中高表达;早期发育阶段在6月龄时表达量最高;12、24、36月龄的表达结果显示,KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量（P<0.05）。同时,设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链,结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因,其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。     

水稻硫转运蛋白基因OsST的亚细胞定位

[目的]构建水稻硫酸根转运基因OsST与YFP黄色荧光蛋白融合表达载体,对OsST蛋白进行亚细胞定位。[方法]从水稻叶片的cDNA中克隆OsST基因ORF全长,测序验证后连入pAT—YFP表达载体,通过基因枪将融合栽体转入洋葱上表皮细胞,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中荧光发光部位。[结果]OsST蛋白定位于细胞膜和核膜上。[结论]为进一步研究硫转运蛋白的功能及硫酸根运输的机理奠定了基础。     

三角帆蚌AMP基因cDNA全序列的克隆及分子特征研究

以三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）为研究材料,根据实验室构建的三角帆蚌cDNA文库中已标注的EST序列, 利用RACE克隆了三角帆蚌AMP基因的cDNA全序列。该cDNA序列全长为970 bp,5′端非翻译区123 bp,3′端非翻译区526 bp,开放阅读框（ORF）长为300 bp,共编码99个氨基酸,包含一段由27个氨基酸组成的信号肽和72个氨基酸的成熟肽,分子量为10 924.7 u。氨基酸序列分析表明,该序列存在明显的跨膜结构和疏水区。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与海兔（Aplysia californica）theromacin氨基酸序列的相似度最高为56%,而与贻贝等中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins相似度较低,推测属于抗菌肽theromacin基因家族。Jpred3软件对三角帆蚌AMP蛋白的二级结构预测结果表明,在第2～22、57～62氨基酸残基处存在α螺旋,因此,三角帆蚌的AMP蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。为进一步研究该基因的表达、功能及三角帆蚌病害防御奠定了分子基础。     

三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析

[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化。[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14。cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57%的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97%。定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织。插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P0.05)。此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L组(P0.05)。[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础。     

拟南芥AGO2的亚细胞定位分析

Argonaute(AGO)是一类高度保守的蛋白,对基因沉默和植物抗病性起重要调控作用。为进一步了解AGO作用机制,今采用生物信息学技术对拟南芥AGO蛋白各成员的细胞定位进行预测,并对AtAGO2进行亚细胞定位分析。10个拟南芥AGO蛋白均不含信号肽序列,表明它们不是外泌蛋白。AtAGO1,AtAGO2,AtAGO3,AtAGO4和AtAGO9带有核定位信号,但携带的核定位信号肽序列各不相同,显示这些AGO蛋白可能定位于细胞核。通过克隆AtAGO2全长序列,构建获得与报告基因eGFP融合表达的细胞定位检测载体pCHF3-eGFP∷AtAGO2,采用农杆菌介导的方法将其瞬时表达于本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中,激光共聚焦显微镜观察结果表明,AtAGO2蛋白定位于细胞质和细胞核中。茉莉酸(jasmonic acid,JA)处理诱导AtAGO2蛋白在细胞质膜及其周围"颗粒化"聚集,但抗病诱导剂苯并噻二唑(benzothiodiazole,BTH)处理不影响AtAGO2蛋白的亚细胞定位。这些结果说明AtAGO2可能通过JA途径参与植物抗病性的调控。     

水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位研究

[目的]探讨水稻水通道蛋白OsPIP2-6的亚细胞定位。[方法]克隆了水稻中的重要通道蛋白OsPIP2—6基因,构建了瞬时表达载体,通过基因枪法在洋葱表皮中进行瞬时表达,并通过激光共聚焦显微镜进行了观察。[结果]水稻水通道蛋白OsPIP2-6主要定位在细胞质膜上,证明了OsPIP2-6是个水通道蛋白。[结论]为植物水通道蛋白的深入研究提供了理论依据。     

小麦病程相关蛋白1基因的亚细胞定位及信号肽鉴定

前期研究克隆获得了一个叶锈菌诱导的小麦病程相关蛋白1基因TaLr35PR1,明确了其基因结构和表达特征。本研究首先预测TaLr35PR1的信号肽和亚细胞定位情况,进而通过试验予以佐证。将信号肽编码的核酸序列克隆、连接到酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI上,并转化到酵母蔗糖酶缺陷菌株YTK12中,明确了TaLr35PR1基因的信号肽具有分泌功能。同时,利用酶切连接的方法成功构建亚细胞定位重组体pCamA-TaLr35PR1-GFP,利用基因枪轰击技术瞬时转化洋葱表皮细胞。结果表明,pCamA-TaLr35PR1-GFP融合蛋白主要在细胞外表达,与亚细胞定位预测的结果一致。这些研究结果丰富了小麦病程相关蛋白1基因的研究内容,为进一步探索该类基因的生物学功能及其作用机制提供了研究基础。     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位分析

为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。     

三角帆蚌cyclin B基因克隆及功能

通过现代分子生物学技术,从三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)中克隆了细胞周期蛋白B(cyclin B)基因的cDNA,得到长度为1 024 bp的序列信息,包括768 bp的ORF,197 bp的3′-UTR,编码255个Aa。进一步分析表明,三角帆蚌cyclin B基因与牡蛎、扇贝具有较高的相似性,其氨基酸序列中具有1个典型的周期蛋白框(cyclin-box),并存在2个周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的作用位点。通过RT-qPCR研究显示:三角帆蚌cyclin B基因在性腺中的表达最高,在雌性中的表达量显著高于雄性(P0.05);而cyclin B基因在其他组织中的表达量均显著低于性腺(P0.05),且无显著雌雄差异(P0.05);沉默cyclin B基因后,除外套膜外,其在性腺和鳃的表达显著降低(P0.05),表明RNA干扰(RNAi)对三角帆蚌不同组织具有不同的沉默效果。流式细胞仪测定RNAi后细胞的分裂时相变化,发现性腺和鳃细胞中G2/M期占比下降,表明cyclin B基因在三角帆蚌中能调控细胞分裂。初步研究了三角帆蚌cyclin B基因及其功能,为三角帆蚌细胞体外建系奠定分子基础。     

三角帆蚌生长性状和内壳光泽度与所育有核珍珠光泽度相关性分析

光泽度为衡量珍珠价值上限的指标,为了研究三角帆蚌供片蚌和育珠蚌对有核珍珠光泽度的相对贡献,以白蚌（内壳主体色为白色的三角帆蚌）为材料,以壳长和外壳青色为选择性状,设置不同选择策略,建立8 组三角帆蚌群体,在每组群体随机选出供片组和育珠组,开展组合插核手术。经18个月培育,发现不同育珠组合中,供片蚌和育珠蚌同时来自 Ⅰ 组选择群体的YAA育珠组合所育珍珠光泽度值最大,比YGG、YHH产珍珠光泽度分别提高15.46%、21.51%;不同组供片蚌培育珍珠的光泽度差异显著,供片蚌内壳光泽度与珍珠光泽度呈极显著正相关（ r = 0.717 ~ 0.939 ）,建立供片组内壳光泽度和珍珠光泽度回归方程为：y=16.81+0.93x(R^2=0.777),供片蚌生长性状与珍珠光泽度相关性不显著;不同组育珠蚌培育珍珠的光泽度差异显著,但育珠蚌生长性状和内壳光泽度与珍珠光泽度不存在显著相关性。以上结果说明幼蚌期选育外壳颜色青色的三角帆蚌,达到了提升珍珠光泽度的目标,可作为选育产高光泽度珍珠三角帆蚌的间接性状,供片蚌内壳光泽度与珍珠光泽度显著相关,以其作为目标性状更优。     

三角帆蚌外套膜细胞培养的改进与大型有核珍珠的培育研究

为得到大颗粒优质的淡水有核珍珠,进行了游离细胞植入法在三角帆蚌(〖WTBX〗Hyriopsis cumingii〖WTBZ〗)内脏团插核育珠的研究。实验采用两种培养基(培养基1、2)进行外套膜外膜细胞的培养,对不同培养时间(2、4、6、12 h)的细胞活力进行检测,同时将处理过的珠核分别置于两组细胞悬液中共培养,6 h后采用内脏团插核手术,对500只三角帆蚌进行插核,并进行为期5个月的淡水有核珍珠生产实验。实验结果表明：细胞活力随培养时间逐渐增大,培养到6、12 h时,两种培养基中的细胞活力较2、4 h时均有显著提高(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.05),6 h与12 h相比差异不显著(〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05);细胞在两种培养基中分别培养,在培养2 h时两组间细胞活力没有显著差异(〖WTBX〗P〖WTBZ〗>0.05),而在培养4、6、12 h时培养基2组的细胞活力显著高于培养基1组(〖WTBX〗P〖WTBZ〗<0.05);培养基2组培养的细胞孵育珠核6 h后,贴附的细胞数量明显增多且分布均匀,插核5个月后,形成了包裹完整、具有光泽、沉积0.8 mm珍珠质的大型珍珠,而采用培养基1组培养的外套膜细胞进行珠核孵育而后插核,得到的素珠较多,且没有形成完整珍珠质包被的珍珠。实验表明改进后的培养基有利于三角帆蚌外套膜细胞培养,从而有利于内脏团有核珍珠的培育,这为进一步开展淡水贝类细胞培养的研究提供了实践基础,为大型有核珍珠的培育提供了依据。     

三角帆蚌所育不同颜色珍珠及其相关组织金属元素种类和含量差异分析

为研究Mn、Mg、Fe、Cu、Zn、Co这6种金属元素对珍珠颜色的影响,选用产自同一养殖池塘的三角帆蚌,比较分析这6种金属元素在内壳色为深紫色、浅紫色和白色的三角帆蚌中分别培育的紫色和白色珍珠中的含量差异,并分析金属元素含量与珍珠L,a,b颜色参数的相关性。结果显示:Mn、Mg、Fe、Co 4种金属元素在深紫色珍珠中均呈现最高含量,在白色珍珠中未检出Fe; Cu除了在三角帆蚌内壳色为浅紫色的珍珠中稍有体现之外,其余组均未检出;Zn在所有颜色珍珠中均未检测出。通过金属元素含量与珍珠颜色参数相关性分析发现,在各颜色育珠蚌组中,所育珍珠的Fe含量均与dE值呈正相关(R~20.83),Mg含量均与L值呈负相关(R~20.80),Mn含量则均与a值呈正相关(R~20.64),仅在深色蚌组中发现,所育珍珠的Co含量与L值的负相关性最高(R~20.94)。进一步比较分析了深紫色、浅紫色和白色三角帆蚌不同部位外套膜以及间液的金属元素含量,深紫色蚌组不同位点外套膜Fe含量存在显著性差异(P0.05),1号位点含量最高;不同壳色蚌的2号位点外套膜Mn、Co含量存在显著性差异(P0.05),其中白色蚌Mn含量显著高于其他两组,深紫色蚌Co含量显著高于其他两组。在白色蚌组的间液中,Mg含量存在显著性差异(P0.05)。综上所述,淡水紫色珍珠的颜色深浅与Fe、Mg、Co、Mn含量存在相关性。     

番茄 SlMAPK7基因的亚细胞定位与组织表达特性

分离番茄 SlMA PK7基因,利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应技术分析在番茄不同组织和花发育不同时期 SlMA PK7的表达特性,发现该基因在雄蕊的表达量明显高于其他组织,在长度4.6～6.5 mm 的花蕾中表达量最高;通过构建黄色荧光蛋白融合表达载体,利用基因枪介导洋葱内表皮细胞的瞬时表达,发现SlMA PK7基因表达蛋白定位在细胞核和细胞膜中;为进一步研究 SlMA PK7的表达特性,分离克隆了SlMA PK7基因的启动子序列,利用 PLACE 和 PlantCARE 软件预测出其含有多种典型的 SlMA PK 启动子顺式作用元件;通过瞬时表达分析该启动子活性,经农杆菌介导转化拟南芥,GUS(β‐glucuronidase ,β‐葡萄糖苷酶)组织化学染色发现,在幼苗期 SlMA PK7主要集中在顶端分生组织和根尖分生组织中表达,在成年植株中则集中在花器官中表达.以上结果表明,SlMA PK7可能在细胞核和细胞膜中参与番茄多种信号的传导,并可能在花器官的发育过程中行使功能.     

短芒大麦钙依赖蛋白激酶基因的克隆与功能分析

【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列,将其命名为HbCDPK;HbCDPK编码的蛋白是一个膜定位钙依赖蛋白激酶,该基因在短芒大麦根、幼苗叶片和成熟胚中均有表达;在低温、干旱、盐和ABA胁迫条件下处理不同时间,HbCDPK的表达丰度有差异,其在低温胁迫条件下的表达信号最强;转HbCDPK基因烟草相对离子渗漏率降低,脯氨酸含量升高。【结论】HbCDPK基因参与了低温胁迫信号转导,具有提高植物抗寒性的潜能。     

重组猪肺表面活性蛋白A在昆虫杆状病毒表达系统的表达及体外抗PRRSV活性初步鉴定

为研究重组猪肺表面活性蛋白A(RpSP-A)的抗病毒活性,采用Bac-to-Bac系统对RpSP-A蛋白进行表达。首先PCR扩增目的基因并将其克隆至pFastBac1转移载体获得pFast-SP-A,通过转化DH10Bac感受态细胞获得重组Bacmid,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-SP-A,在sf9细胞上进行目的蛋白的表达,经镍柱纯化、脱盐柱处理后,采用蚀斑减少方法评价RpSP-A对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用。结果显示RpSP-A在sf9细胞中得到正确表达,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染,补加Ca~(2+)时30μg/mL RpSP-A抑制率高达77%,15μg/mL RpSP-A抑制率为43%,未补加Ca~(2+)时RpSP-A没有表现出抑制作用。上述结果表明利用Bac-to-Bac系统可以稳定获得大量具有抗PRRSV作用的可溶性RpSP-A。