玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

大豆种子特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从大豆中克隆得到β-伴球蛋白α亚基基因的启动子序列7αP,并对其进行功能分析。【方法】利用PCR技术从大豆基因组DNA中分离β-伴球蛋白α亚基基因启动子序列7αP,将其与GUS基因融合,构建种子特异性表达载体p7αP-GUS,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,对再生植株进行PCR、Southern blot检测和GUS组织化学分析。【结果】序列分析表明,7αP长度为1 382 bp,其中含有多种种子特异性启动子的序列元件,如RY重复序列元件、E-box、SEF1-motif、SEF4-motif(、CA)n、Dc3启动子结合因子和ACGT序列元件及一些诱导物应答元件。转基因植株的PCR和Southern blot结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,仅能在种子中检测到GUS活性,而在根、茎和叶等其他组织中均未检测到GUS活性。【结论】大豆β-伴球蛋白α亚基基因上游1 382 bp片段具有种子特异性启动子功能,7αP为种子特异性启动子。     

玉米蔗糖合酶基因启动子的克隆及功能分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,Su Sy)是植物蔗糖代谢中的一类关键酶,在植物的生长发育过程中具有重要功能。以玉米自交系"B73"的基因组DNA为材料,通过PCR扩增出玉米蔗糖合酶基因SH1起始密码子上游1853 bp序列。生物信息学结果显示该序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件,参与干旱诱导的MYB结合位点,根、胚乳等器官表达响应元件。构建了由SH1启动子驱动报告基因Gus的植物表达载体,通过农杆菌介导法产生了水稻转化株系,Southern印迹结果显示获得了单拷贝的"中花11"转基因植株(PSH1)。组织化学分析和实时荧光定量PCR结果表明,Gus基因在根、茎、叶、叶鞘及颍壳中高效表达,但在花和种子中不表达。综上可知,SH1启动子是一个新颖的营养器官特异型启动子,在作物的品质改良中具有良好的应用前景。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

水稻胚特异表达基因Os08PTS启动子的克隆及分析

为分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良.依据T-DNA插入位点信息,克隆Os08PTS基因启动子,并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征,同时构建启动子与GUS融合表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,验证启动子的表达特征....     

玉米淀粉合成酶SSⅡa启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆玉米Zea mays淀粉合成酶SSⅡa启动子,并分析其功能,为进一步研究和应用SSⅡa启动子奠定基础。【方法】通过NCBI上公布的玉米基因组序列,在网站Maize GDB上BLAST查找到SSⅡa 5'侧翼序列,利用PCR方法从玉米B73中克隆SSⅡa启动子;通过Plant Care在线分析启动子顺式作用元件,用特异性引物分别克隆出长度为1 407、867、633、483和365 bp的片段,与植物表达载体p CAMBIA3301连接,构建5种5'缺失体的植物表达载体,命名为P1、P2、P3、P4和P5。用农杆菌介导法转化拟南芥Arabidopsis thaliana,获得转基因拟南芥。【结果】以玉米B73基因组DNA为模板,用特异性引物SSⅡa F/SSⅡaR进行扩增,得到2 526 bp序列;除草剂筛选的阳性拟南芥植株PCR验证均检测出gus基因;GUS组织化学分析表明,5种类型启动子构建的表达载体在成熟期叶片、果荚中均显蓝色;gus基因定量分析表明,成熟期5种转基因拟南芥叶片中,gus基因表达量P1最高,其他基本一致;种子中gus基因表达量P1和P2相近,且高于P3、P4和P5。【结论】成功克隆玉米SSⅡa启动子;构建的5种SSⅡa启动子缺失体表达载体在转基因拟南芥中均具有活性,长度为1 407 bp(P1)和867 bp(P2)的启动子具有胚乳特异性。     

玉米ZmCKX1基因的克隆及功能分析

利用RT-PCR技术,从玉米自交系郑58中克隆了编码细胞分裂素氧化酶1的基因(Zm-CKX1),该基因阅读框全长为1 608bp,编码535个氨基酸,蛋白质分子量为57kD,理论等电点pI=5.22。该基因与TaCKX1、AtCKX在核苷酸水平上同源性分别为69%、49%。通过实时荧光定量PCR的方法对该基因的表达模式进行了分析,结果表明,在玉米雌穗中随着授粉时间的延长,ZmCKX1基因表达量逐渐升高,并且ZmCKX1基因在郑单958及其亲本、安玉5号及其亲本雌穗中的表达量明显不同,表现为超低显性表达模式。因此推断,ZmCKX1基因可能是一个与杂种优势相关的基因。     

青蒿非分泌型腺毛特异TPS7基因启动子的克隆及功能分析

研究运用基因组步移法克隆了长度为1 167bp的青蒿启动子proTPS7,经生物信息学分析发现了proTPS7中的多个顺式调控元件。构建启动子与GUS融合载体,稳定转化青蒿并对转基因植株进行GUS染色实验,结果表明该启动子能驱动报告基因在非分泌型腺毛中的特异表达。对转基因青蒿喷洒甲基茉莉酸和脱落酸,3h后GUS基因表达水平有所上调,说明proTPS7能受到上述2种激素的诱导。     

小麦TaPR1基因启动子的克隆及启动活性分析

PR1是植物病程相关（Pathogenesis related,PR）蛋白家族成员之一,参与植物抗病防御反应。研究前期明确了小麦TaPR1基因受叶锈菌及信号分子水杨酸（Salicylic acid,SA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）的诱导表达。本研究基于中国春小麦数据库,克隆获得了小麦TaPR1基因上游2 200 bp启动子序列,对启动子区域所包含的顺式作用元件进行分析预测,利用β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase,GUS）组织化学染色、绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）观察对不同长度启动子区段进行启动活性验证,结果表明TaPR1基因启动子-2 200～-290 bp区段具有启动活性,为进一步解析TaPR1基因转录调控机制提供了理论依据。     

玉米ZmPGP1基因启动子的克隆及结构功能分析

为分析玉米ZmPGP1基因启动子的功能,利用巢式PCR方法克隆出了玉米ZmPGP1基因的启动子调控区,并将该启动子与GUS基因融合,通过基因枪法转入玉米(Zea mays)中,分析ZmPGP1启动子表达特性。结果显示,在玉米中克隆出ZmPGP1基因5′端上游1 090bp的启动子序列,该启动子序列包括光响应元件、激素响应元件和胁迫诱导及发育相关顺式作用元件。GUS染色表明ZmPGP1基因在玉米幼苗的茎部、叶子及根中都有表达,其中茎的节间处以及叶鞘部位表达量较高,这与ZmPGP1基因的Real-time PCR分析结果一致。研究结果进一步阐明ZmPGP1基因的功能以及作用机理。     

高效生物诱导玉米单倍体及加倍方法的研究

【目的】探讨高效的玉米单倍体诱导和加倍方法。【方法】以北方春玉米区高抗茎腐病的自交系Z99和高感茎腐病的自交系R120的杂交F1代为母本,以5个诱导系(Y601~Y605)为父本,进行单倍体杂交诱导试验;以秋水仙素作为玉米单倍体人工染色体加倍药剂,采取4种处理方法(浸种法、浸芽法、滴心叶法、注射法),每种方法设置3个质量浓度梯度(0.1,0.3和0.5mg/mL)进行单倍体加倍试验。【结果】单倍体诱导试验表明,延迟授粉(长花丝≥8cm)的平均单倍体诱导率为17.4%,约为正常授粉(短花丝≤4cm)条件下的3.3倍;伏后授粉的诱导率平均为18.9%,约为伏期授粉的3.3倍。秋水仙素加倍试验中浸种法对植株伤害较严重,存活率低于50%;注射法(0.5mg/mL)和滴心叶法(0.3mg/mL)的散粉率较高(46.9%,28.3%),相应的结实率也较高(14.6%,10.9%)。【结论】花丝长短和授粉时间对玉米单倍体诱导率有重要影响,延迟授粉时间和较低的温度有利于提高单倍体诱导率;秋水仙素加倍玉米单倍体时注射法处理效果最好,滴心叶法次之。     

种子出苗率对玉米个体生长和群体产量的影响

为研究精量播种条件下玉米出苗率对产量的影响,采用‘郑单958’、‘京科968’和‘晋单73’3个玉米杂交种,在田间单粒播种条件下设置80%、85%、90%、95%和100%,5种出苗率,测定群体产量的变化。结果发现,3个品种的株高和穗位高不受出苗率影响,但果穗单穗重和穗长随出苗率的降低而增大,相反秃尖长度则减小。3个品种的产量在出苗率为100%时最高,随着出苗率的降低,产量呈现先轻微下降后显著下降的趋势,‘郑单958’和‘京科968’在出苗率低于95%时产量开始显著下降、而‘晋单73’则在低于90%时才显著下降。因此,为保障单粒播种玉米的高产稳产,‘郑单958’和‘京科968’的种子出苗率应该达到95%以上,‘晋单73’应达到90%以上。     

玉米花期性状主效QTL（基因）的SSR标记

【目的】筛选玉米花期性状主效QTL(基因)的SSR标记,为玉米分子育种与相关基础研究提供参考和依据。【方法】选用花期不同的玉米自交系JZ8、JZ16、JW1100为亲本,分别组配得到2个杂交后代F1(JZ8×JW1100)和F1(JZ16×JW1100),F1经自交获得2个F2(JZ8×JW1100)、F2(JZ16×JW1100)群体。从前人已报道的与玉米花期相关性状主效QTL(贡献率10%)连锁的SSR标记中,选取30对SSR标记引物,利用亲本、F1代对这30对引物进行筛选,将获得的特异性引物再通过F2群体单株花期性状与单株SSR标记的符合度和准确率验证,筛选出符合率大于50%的主效标记。【结果】umc1875、umc1016、bnlg1651、umc1115为玉米花期性状的主效SSR标记,其中标记umc1875适宜用于筛选抽雄期(DTT)、散粉期(DTP)、吐丝期(DTS)晚的材料,筛选准确率分别为57.5%,66%和61%;标记umc1016适宜用于筛选散粉期和吐丝期早的材料,筛选准确率分别为66%和58.5%;标记bnlg1651和umc1115适宜用于筛选散粉期早的材料,筛选准确率分别为69%和62.5%。【结论】筛选出4个与花期性状连锁且高通用性的标记,在分子水平上揭示了材料之间的内在联系,在某种程度上揭示了对不同的玉米材料在分子水平上直接对目的性状进行选择的可能性。     

拟南芥AtWRKY33基因启动子的克隆及表达分析

以野生型拟南芥为材料,采用PCR技术克隆得到了拟南芥AtWRKY33基因起始密码子ATG上游1 629 bp启动子序列,并利用该启动子驱动GUS基因在野生型拟南芥中表达,对获得的转基因拟南芥采用重金属Cd处理不同时间,进行GUS染色及定量分析。结果表明：AtWRKY33基因启动子与GUS融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达;拟南芥植株中的AtWRKY33基因在根中大量表达;定性与定量实验均显示经重金属Cd处理后的拟南芥幼苗中AtWRKY33基因随着时间增加而被显著诱导表达。说明该基因响应重金属Cd胁迫。     

玉米肌动蛋白解聚因子ZmADF4基因克隆、转录活性及表达分析

【目的】克隆玉米肌动蛋白解聚因子4（ZmADF4）基因,并对其转录活性和表达模式进行分析,为探究玉米ADF家族基因的功能及调控机制提供参考依据,也为玉米抵抗逆境胁迫研究提供潜在的基因资源。【方法】采用同源克隆技术克隆玉米叶片ZmADF4基因,运用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、保守结构域及二、三级结构;通过原生质体瞬时转化进行亚细胞定位;利用酵母自激活分析该基因转录活性,下载RNA-Seq数据分析其在不同组织中的表达特性,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同逆境胁迫下的表达情况。【结果】从玉米叶片克隆获得的ZmADF4基因,编码区（CDS）长度为420 bp,编码139个氨基酸残基,蛋白分子量为15.855 kD,理论等电点（pI）为7.66,属于亲水性蛋白,具有典型的植物ADF蛋白家族的保守结构域ADF_gelsolin,主要定位于细胞质中。ZmADF4基因不具有转录自激活效应,且在根、茎、叶、花丝、花药、胚、胚乳和果皮等组织中呈差异性表达,在茎、果皮和叶片中表达量较高。ZmADF4基因对高温胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、干旱胁迫及脱落酸处理均有响应,其中高温胁迫下,整体呈上调表达趋势,而低温胁迫和脱落酸处理下,整体呈下调表达趋势,干旱和高盐胁迫下则呈先上调再下调表达的趋势。【结论】ZmADF4基因属于ADF基因家族成员,不仅参与玉米茎、果皮和叶片的生长发育调控,还参与低温、高温、干旱、脱落酸、盐胁迫等逆境响应调控。     

大豆铁蛋白基因GmFerritin在玉米中的遗传转化

使用In-Fusion试剂盒构建表达载体pCUB-Zein::ferritin-35s::bar,以玉米自交系齐319茎尖分生组织为受体,采用农杆菌介导法,将玉米胚乳特异启动子基因15 kDβ-Zein驱动的大豆铁蛋白ferritin基因转入玉米,共筛选出272株除草剂(草铵膦)抗性植株,其中108株PCR检测呈阳性,转化率达3.6%,初步判断Zein::ferritin基因已转入玉米基因组中。