酵母双杂交技术筛选朊蛋白PrP23-231互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以pSos-PrP23-231载体为诱饵质粒,筛选小鼠脑cDNA文库中能与朊蛋白PrP23-231相互作用的蛋白。通过一次筛选,三次验证,从小鼠脑cDNA文库中得到2个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到2个候选基因序列,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析,得到的蛋白编码基因可能与朊蛋白存在相互作用,其作用可能与疯牛病发病机制有关。     

酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的蛋白

利用酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与A型流感病毒PB1-F2相互作用的宿主蛋白,为研究PB1-F2蛋白的功能提供依据。构建pGBKT7-PB1-F2诱饵重组载体,在证实诱饵蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛选人白细胞文库中与PB1-F2相互作用的细胞蛋白。对阳性克隆进行测序和生物信息学分析,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。Western blot结果表明,酵母表达载体pGBKT7-PB1-F2在酵母中成功表达PB1-F2融合蛋白。酵母双杂交筛选并验证,获得了8个与流感病毒PB1-F2蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究有助于在分子水平上探索PB1-F2蛋白的新功能,为揭示流感病毒的致病机理奠定基础。     

利用酵母双杂交系统筛选BmNPV PE38的互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的PE38蛋白为诱饵,从感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白编码基因,为探讨BmNPV PE38在侵染家蚕过程中的作用提供线索。将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-Pe38转化到酵母菌Y2HGold中,并将含有感染BmNPV的家蚕中肠组织cDNA文库的Y187酵母细胞与含有pGBKT7-Pe38的酵母细胞共同培养,初筛出8个有匹配结果的候选蛋白基因,经功能搜索后筛选到2个与病毒复制有关的蛋白基因,通过测序和生物信息学分析,这2个基因编码的蛋白质可能是与BmNPV的PE38蛋白有相互作用的候选蛋白,分别为家蚕丝氨酸蛋白酶和过氧化氢酶。     

应用酵母双杂交系统初步筛选IBDV VP2结合蛋白

用RT-PCR扩增VP2 cDNA并克隆入诱饵载体pSos,与鸡法氏囊cDNA文库中分离的质粒DNA共转化cdc25H,筛选阳性酵母克隆;用酵母质粒DNA转化大肠杆菌,提取质粒再分别与诱饵载体pSosVP2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交系统对阳性克隆进行验证.对阳性克隆的插入片段进行序列分析,根据生物信息学分析结果初步确定IBDV VP2结合蛋白编码基因.结果显示,经酵母双杂交共筛选出48个候选阳性克隆,分别转化酵母菌,经酵母双杂交验证后,获得阳性克隆19个.进一步的序列分析显示,在19个插入序列中,共编码8种不同的多肽,分别是Ras超家族中的RRAS2、Rit1和N-Ras,肿瘤相关蛋白TCTP和PARP14,抗病毒Mx蛋白,LAMB3蛋白以及蛋白激酶PRKX.VP2候选结合蛋白的获得为IBDV受体、诱导细胞凋亡或逃逸宿主抗病毒机制等研究奠定了基础.     

酵母双杂交系统筛选猪流行性腹泻病毒N蛋白互作的宿主蛋白

为了获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白与宿主细胞中的互作蛋白,本研究构建PEDV N蛋白基因的重组载体p GBKT7-N,以其作为诱饵质粒,采用酵母双杂交方法,从猪肺泡巨噬细胞(PAM)cDNA文库中筛选出与N蛋白相互作用的蛋白。结果表明,诱饵蛋白在酵母双杂交系统中不存在毒性和自激活作用,而且筛选出6种与N蛋白互作的蛋白,分别为FTH1、LGALS3、CORO1C、SNRPG、KRTAP5-3和ZNF598。其中半乳糖凝集素3(LGALS3)和小核糖蛋白G(SNRPG)通过回返试验和免疫共沉淀试验证实其与PEDV的N蛋白存在特异性相互作用。本研究为进一步研究PEDVN蛋白的功能及病毒的致病机制奠定了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白(TRADD)相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10~6 CFU,平均插入片段在1.5kb左右,文库重组率95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白（TRADD）相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10⁶ CFU,平均插入片段在1.5 kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

鹅细小病毒VP2和VP3蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。     

基于酵母双杂交文库鉴定鸡PGCs形成过程中的关键泛素化修饰酶

试验拟筛选与C2EIP互作的蛋白,构建调节PGCs形成过程的泛素化E3连接酶复合体。通过逆转录和同源重组等方法构建鸡PGCs酵母文库;将C2EIP连入诱饵空载体pGBKT7中,并转化酵母感受态细胞进行诱饵载体(C2EIP-pGBKT7)的毒性和自激活检测;将酵母文库与诱饵载体菌液共培养后,通过涂板筛选阳性克隆并进行测序和生物信息学分析筛选互作蛋白。结果显示：成功构建了鸡PGCs酵母文库,其滴度为3.0×10⁶ cfu/mL,总库容为1.5×10⁷ cfu,且重组率为100%,符合筛库要求。成功构建无毒性和不能自激活的C2EIP-pGBKT7诱饵载体,能够用于后续的文库筛选。C2EIP-pGBKT7诱饵载体菌液与酵母文库共培养后,通过PCR测序与蛋白序列分析后共筛选了36个C2EIP的互作蛋白,其中RCJMBM04和CCDC174蛋白功能域分析发现分别具有典型的RING功能域和PPXY基序,进行的生物信息学分析发现WWP1和WWP2具有典型的WW功能域,能够与CCDC174结合。研究表明,试验成功鉴定了C2EIP/RCJMB04/CCDC174...