广西六堡茶“金花”菌的分离与分子鉴定

从广西银泰六堡茶厂2008年产(编号6918)的六堡茶中分离纯化得到一株特征菌株"金花"菌,用传统的形态学分离鉴定,观察菌落特征,并运用光学显微镜观察菌株形态。同时结合现代分子生物学DNA测序,在分子水平上对分离菌株进行鉴定。根据菌株的表观形态、光学显微镜和DNA序列分析,通过ITS序列同源性搜索比对及系统发育树的构建,确认该菌株为Eurotium niveoglaucum。     

茯砖茶冠突散囊菌多样性初步研究

从湖南的不同地区采得较具代表性的茯砖茶样品7种,分离纯化各样品中优势微生物"金花菌"。以广东微生物研究所鉴定确认的冠突散囊菌(Eurotium cristatum)作为标准菌株,描述并比较各菌株平板培养下菌落大小、形状、颜色、质地等特征,以及电镜下有性型与无性型等生理结构的差异,并依据各菌株形态特征上的典型差异对它们予以初步命名。结果表明:七株菌株均属于冠突散囊菌,但在形态和在生理等特征上有四种却表现出较为明显的分化,可能属于冠突散囊菌的变型。本研究为冠突散囊菌多样性的鉴定与不同生理小种的命名提供了基础。     

冠突散囊菌在不同茶类及几种植物材料上“发花”的研究

试验采用几种不同茶类和植物材料为研究对象,在模拟茯砖茶工艺条件下进行"发花"试验。结果表明,在没有冠突散囊菌接种的情况下几种试验茶类和植物材料均可获得良好的"发花"效果。通过对"发花"菌采用稀释平板分离法得到的菌株进行菌落特征分析和个体形态观察,可初步判断为冠突散囊菌。并对冠突散囊菌的营养需求、孢子传播途径以及开发多功能复合保健茶的可行性进行了探讨。     

对蓟马类害虫高致病性球孢白僵菌的分离、鉴定

从草履蚧僵虫体内分离出12株病原真菌,对蓟马类昆虫具有70%~90%的致死率。现选出一株病原真菌CYT10利用形态和分子的特点进行鉴定。扫描电镜下观察,该菌产孢细胞簇生瓶状,“之”型产孢轴。经PCR获得rDNA-ITS和EF1-a核苷酸序列,与其他球孢白僵菌的相应序列一致性达95%以上,进化分析CYT10菌株与球孢白僵菌Beauveria bassiana聚为一类。根据菌株的形态观察和DNA序列分析确定该菌为球孢白僵菌。     

β-微管蛋白联合ITS序列在金花菌鉴定中的应用

"金花"是曲霉属(Aspergillus)真菌在砖茶内部经"发花"工艺形成的黄色闭囊壳,"金花"菌原为茯砖茶所特有的一种真菌。目前对于金花菌群的分离鉴定多是通过形态学特征或ITS序列等方法,其鉴定结果存在较大差异。本课题组通过β-微管蛋白联合ITS序列对来源于茯砖茶和普洱茶的"金花菌"进行了生物学地位的鉴定。根据分离菌株的菌落特征、显微形态的观察、ITS序列和β-微管蛋白基因(BenA)的测序及系统进化树的构建,结果表明:单纯通过ITS序列比对,会产生多种鉴定结果,而通过β-微管蛋白基因(BenA)序列可弥补ITS序列在曲霉属真菌种间鉴定的不足,两者结合可很好地对曲霉属真菌进行种间鉴定。此研究结果可为"金花菌"分离鉴定方法提供参考。     

普洱茶样中“金花”微生物的分离鉴定

＂金花＂是茯砖的品质特征,部分普洱茶样品也有＂金花＂,但是对普洱茶中＂金花＂微生物研究较少。本文从1个类似＂金花＂的普洱茶样品中,分离出4株真菌,经形态观察和ITS序列同源性搜索比对鉴定为塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、伞枝犁头霉（Lichtheimia corymbifera）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和黑附球菌（Epicoccum nigrum）。在自制的普洱茶砖上接种阿姆斯特丹散囊菌,茶砖表面也长出类似的＂金花＂,表明该普洱茶样品的＂金花＂是阿姆斯特丹散囊菌的闭囊壳。     

引起广西桑树“褐枯”的病原菌及致病机制研究

对广西地区的桑树发病初期叶片褐枯情况进行调查，通过收集桑树病株并进行分离。结果表明，得到优势菌株42株，各菌株形态基本一致。对分离到的菌株进行16S rDNA序列鉴定，比对后发现所有菌株序列均与劳尔氏青枯菌Ralstonia solanacearum（RS）相似度达99％，生化型分析结果显示主要为生化Ⅰ型。随机选择10个菌株进行致病力实验，结果表明，各菌株均具有致病性，部分菌株致病率达90％以上。其后利用扫描电镜观察青枯菌侵染桑苗过程，发现侵染后期桑根木质部导管内聚集大量菌体，堵塞整个导管。上述结果表明：广西地区桑树“褐枯”症状病害属于桑树青枯病，病原菌为劳尔氏青枯菌RS，其致病机制是通过在桑根木质部导管内大量定殖，堵塞导管阻止水分运输，最终导致植株枯萎死亡。     

茯砖茶“金花”菌的分离、鉴定及转化葛根产物研究

为研究茯砖茶中"金花"菌是否能在葛根上生长,并进行生物转化,得到活性更高的发酵产物。从茯砖茶中分离出一株优势菌株LS1,并进行鉴定;以野葛、粉葛、葛渣为底物进行固体发酵,以DPPH自由基清除法比较发酵前后产物抗氧化活性,并测定了总黄酮含量及采用高效液相色谱法检测葛根素质量浓度。结果表明,LS1经形态学观察及ITS-5.8S r DNA序列分析,鉴定为冠突散囊菌Eurotium cristatum,Gen Bank登录号为KR812327;野葛、粉葛、葛渣固体发酵后总黄酮和葛根素含量分别提高了15.97%、12.33%、20.69%和20.48%、7%、20.29%。     

黑茶发花过程中冠突散囊菌对茶叶中游离氟含量的影响

为揭示黑茶发花过程中冠突散囊菌对茶叶中游离氟含量的影响,分别用出发菌株和诱变菌株对毛尖绿茶与黑毛茶进行纯种散茶“发花”,测定不“发花”茶叶、“发花”后去掉“金花”的茶叶、“金花”颗粒及液态发酵前后茶汤中的游离氟含量。结果显示：冠突散囊菌出发菌株与诱变菌株均使黑毛茶的游离氟含量升高,分别较不“发花”的对照茶样提高7.94%和10.47%,但均对毛尖绿茶的无影响;“金花”颗粒含一定量的游离态氟;冠突散囊菌能少量吸收茶汤中的氟,且吸收量与茶汤中游离氟的原始含量无相关性;冠突散囊菌对茶叶中游离氟含量的影响因茶叶的含氟水平不同而异,对氟无富集作用。     

利用卡氏白和尼罗红染色观察稻瘟病菌有性世代的结构

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是异宗配合的子囊菌,但至目前,关于其有性世代产生过程和结构的研究相对较少。本研究利用两个稻瘟病菌菌株Guy-11与2539在多种培养基上进行杂交试验,观察有性世代产生情况。结果表明,两菌株在所有参试培养基上杂交后均能产生子囊壳,但子囊壳的数量、产生速度和成熟度各不相同,以燕麦培养基为最佳。为了进一步观察有性世代的结构,我们采用卡氏白和尼罗红对子囊和子囊孢子进行染色和荧光观察。荧光显微镜下,子囊和子囊孢子的细胞壁均能被卡氏白染成清晰的亮蓝色,细胞结构清晰可辨。成熟的子囊壳内可产生大量的子囊,子囊中含有8个子囊孢子,子囊孢子通常含有4个细胞。同时,子囊孢子能够被尼罗红染成橘红色,表明子囊孢子中储藏大量的脂肪类物质。本研究提供了一种有效的观察稻瘟病菌有性世代结构的荧光染色方法,为后续的研究奠定了基础。     

饮用金花香橼茶3个月对小样本高脂血症人群糖脂代谢的改善效果研究

探讨一款用黑茶工艺、经冠突散囊菌发花的乌龙茶——金花香橼茶饮用3个月对小样本高脂血症人群糖脂代谢的临床改善效果。招募38名志愿者,试饮金花香橼茶3个月,通过检测和对比试饮前后的体成分（体重、体脂百分比等）、血液生化指标（空腹血糖、血尿酸、血脂四项）、肝脏超声、肠道菌群等,探讨金花香橼茶的健康功效。结果表明,试饮金花香橼茶3个月后,志愿者体重、体质指数、体脂百分比、内脏脂肪等级、血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、空腹血糖显著降低（P<0.05）,脂肪肝严重程度减轻,肠道菌群均匀性和多样性增加,考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、韦荣球菌属（Veillonella）等丰度升高,戴阿利斯特杆菌属（Dialister）、丁酸蓖麻单胞菌属（Butyricimonas）丰度降低。提示金花香橼茶具有辅助降血糖、降血脂、改善非酒精性脂肪肝的作用,可能通过增加产短链脂肪酸菌属的丰度,增加短链脂肪酸,改善胰岛素抵抗,进而改善糖脂代谢。本研究所得结果仍需更加严谨的长期试验进一步加以确证。     

"香山早"茶树品系的DNA指纹鉴定研究

应用DNA指纹分析技术对三门“香山早”3个不同茶树品系与本省5个主要的特早生茶树品种进行遗传鉴定。19个引物RAPD分析共扩增出126条谱带589个位点,其中多态性占78％。DNA指纹分析表明,“香山早1号”和“香山早2号”属于同一遗传类型;供试比较的5个特早生品种与该3个品系是不同的遗传类型。     

不同品种茶树根际AM真菌群落结构分析

对陕西安康汉水韵茶园栽培的5个品种茶树根际丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza,AM）真菌群落结构特征进行分析,以期丰富我国茶树AM真菌种质资源库。结果表明,不同品种茶树根际AM真菌种丰度及种属组成等存在差异。其中,紫阳群体种茶树根际分离的AM真菌最多（6种）,陕茶1号、龙井长叶、龙井43和福鼎大白茶各分离到5、4、4种和3种。龙井长叶茶树根际AM真菌孢子密度最高（每克干土含3.57个孢子）,龙井43最低（每克干土含1.10个孢子）。紫阳群体种茶树的AM真菌物种多样性Shannon-Wiener和均匀度指数均达到最高,分别为0.63和0.096,龙井长叶最低（0.18和0.027）。龙井长叶的菌根定殖率最高（29.5%）,福鼎大白最低（15.8%）。不同茶树品种AM真菌种类组成的相似性系数维持在0.111~0.750,其中,龙井长叶与龙井43茶树根际AM真菌种类组成相似性系数最高,而福鼎大白和紫阳群体种相似性系数最低。研究表明,不同品种茶树根际AM真菌群落结构存在一定的差异,根际土壤中鉴定的AM真菌资源对进一步筛选和研发茶树专用AM真菌菌剂,促进茶产业发展具有重要意义。     

应用RAPD分子标记分析“晚绿”品种的杂交亲本

应用随机扩增多态性DNA (RAPD)技术对茶树无性系品种“晚绿”进行亲子关系分析。所用 10 8条随机引物中的 93条引物对日本静冈和枕畸两地取样的 6个无性系茶树品种的 8份材料的基因组DNA分别扩增出 1- 8条谱带 ,平均每条引物 3 5条。其中 19条引物扩增出“晚绿”与其母本“数北”不同的RAPD分子标记 30个。从中选择 6条引物对 8份供试材料的基因组DNA鉴定表明 ,其中 4个RAPD分子标记显示出“晚绿”品种特异性 ,说明包括“静在 16”在内的 4个供试品种都不是“晚绿”的真正父本。本文还证明 ,不同生态条件下生长的同一无性系茶树品种的基因组DNA具有遗传保守性     

茶树Bt和Cpti双价抗虫基因转化研究（简报）

利用转基因获得抗虫茶树品种是防治茶树害虫的重要途径。将含有Bt和Cpti双价抗虫基因的质粒转入感受态E.coitl DH5α菌株并进行培养、提取和扩增后的质粒,注入茶树花期的子房内,种植接种后的茶籽,并对获得的植株进行检测。     

不同种类微生物对普洱茶发酵过程的影响

为阐明微生物在普洱茶发酵过程中作用机制,进行了普洱生茶单菌发酵实验,通过跟踪不同菌种对普洱茶发酵过程中感官品质和理化指标的影响,发现不同微生物对普洱茶发酵的作用,并对优势菌种进行混菌发酵实验,以期为工业化微生物发酵普洱茶提供理论和数据支持。结果表明,普洱茶发酵过程中,叶色由黄绿变为猪肝色,茶汤的苦涩感逐渐减弱,汤色红浓明亮,理化成分中茶多酚和水浸出物含量均减少,茶褐素和咖啡碱含量增加,且霉菌对这些成分的影响最大,酵母次之,细菌最小。混菌发酵茶样20d即具有普洱熟茶的品质。结果证明采用合理配比微生物发酵普洱茶可以缩短发酵时间,而且能更好地控制和规范普洱茶的发酵趋势和结果。     

茶树种质资源EGCG3"Me含量及其变化规律研究

采用HPLC分析技术对国内茶树种质资源的EGCG3"Me含量及其变化规律进行了研究。结果表明：在200份高多酚茶树种质中发现EGCG3"Me的含量大于1%的茶树种质有6个;茶梢中EGCG3"Me的含量随着叶片成熟度的提高而增加,并且秋季新梢高于夏季新梢;绿茶加工过程能有效保持鲜叶中EGCG3"Me含量,而乌龙茶加工过程的萎凋工序中茶叶中EGCG3"Me含量有明显增加。     

从湖北青砖茶渥堆过程中分离真菌总状枝毛霉菌的鉴定与模拟发酵研究

对从青砖茶发酵堆中纯化分离的主要微生物进行鉴定。采用平板梯度稀释法对发酵茶渥堆中的微生物进行纯化分离;选取1株菌株LC-2利用分子生物学手段结合形态学鉴定等方法进行分类鉴定;并用高浓度冷冻菌粉对小鼠进行灌胃试验,检测急性毒理效果;最后对菌株LC-2进行青砖茶固态模拟发酵效果验证。结果表明,真菌LC-2菌落形态与显微形态与总状枝毛霉菌（Mucor racemosus Fres）相似,分子鉴定结果与总状枝毛霉菌（Mucor racemosus Fres）同源性最近,因此确定为总状枝毛霉菌（Mucor racemosus Fres）。菌粉灌胃未见对动物造成急性毒理损害。利用该菌株发酵生产的青砖茶汤色红黄,香气甜香略青,滋味绵软略甜,与传统工艺生产的青砖茶品质无大差异。由此证明该菌株确实是参与青砖茶渥堆发酵过程的重要菌株,并可以利用于未来青砖茶自动化发酵过程。     

茶树种质资源EGCG3″Me含量及其变化规律研究

采用HPLC分析技术对国内茶树种质资源的EGCG3″Me含量及其变化规律进行了研究。结果表明：在200份高多酚茶树种质中发现EGCG3″Me的含量大于1％的茶树种质有6个;茶梢中EGCG3″Me的含量随着叶片成熟度的提高而增加,并且秋季新梢高于夏季新梢;绿茶加工过程能有效保持鲜叶中EGCG3″Me含量,而乌龙茶加工过程的萎凋工序中茶叶中EGCG3″Me含量有明显增加。