柑橘木虱黄龙病菌携带量与其内生菌群相关性

【目的】分析柑橘木虱（Diaphorina citri）体内可能与黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）互作的内生细菌,为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌（带菌）和不带菌黄龙病菌（不带菌）的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分,经PCR扩增其16S rDNA的V6-V8区,用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法,比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌：Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析,再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量,数据经LSD检验,以各种细菌相对含量的-lg值作图,先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系,再比较同种细菌在不同样品中的特性,分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株,分属于芽孢杆菌属（Bacillus,3株）、欧文氏菌属（Erwinia,1株）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella,1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus,2株）、节杆菌属（Arthrobacter,1株）、泛菌属（Pantoea,2株）、果胶杆菌属（Pectobacterium,1株）、沙门氏菌属等（Salmonella,1株）、链霉菌属（Streptomyces,1株）、Massilia brevitalea（1株）等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到,分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11（嗜气芽孢杆菌属）在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%,表明其为木虱体内常驻细菌;对木虱不同部位（头、胸、腹）内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示,带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显,带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 （Wolbachia sp.）、12（Wolbachia pipientis）、13（Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri）、14（Uncultured bacterium）、19（Serratia marcescens）、21和22（均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）在木虱体内稳定存在,带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.,木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性,同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构;嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）在柑橘木虱体内稳定存在,为木虱体内常驻菌群;Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关,推测其可能与黄龙病菌互作。     

设施栽培黄瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选

通过从PDA平板对峙培养试验设施黄瓜内生细菌中筛选出对枯萎病菌（Fusarium.Oxysporum f.sp.cucumberium Owen.）具有拮抗效果的菌株,作为将来进行黄瓜病害生物防治的资源菌株。结果表明,52株内生细菌中有14个菌株对枯萎病菌有拮抗作用,占菌株总数的26.9%,抑菌圈半径最大的可达6mm。     

一株辣椒青枯病菌拮抗内生细菌的筛选鉴定与发酵条件优化

【目的】筛选对辣椒青枯病菌生防效果较好的内生细菌,丰富辣椒青枯病的生物防治菌种资源,为生防制剂的研发生产及进行大田生物防治提供理论依据。【方法】在湖南长沙青枯病发病区采集健康的辣椒植株样品,通过平板稀释分离和划线纯化方法获得内生细菌后采用琼脂扩散法进行拮抗作用测定,筛选出拮抗青枯病菌效果较好的内生细菌,然后通过菌体的形态结构观察、生理生化特性试验及16S r DNA序列同源性分析,对筛选出的细菌进行鉴定,采用正交试验对其发酵条件进行优化试验。【结果】筛选出一株对青枯病菌拮抗作用效果好的内生细菌L009,通过对其形态学、生理生化特性鉴定和16S r DNA序列的系统发育鉴定,该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通过正交试验,确定该菌株的最佳发酵条件为：玉米淀粉8%、豆饼粉6%、Na Cl 0.5%、Ca CO30.5%、K2HPO40.08%、p H 7.0、72h、28℃、180 r/min转速。【结论】L009菌株对辣椒青枯病菌具有较好的拮抗作用,具有作为生防制剂的潜力。     

苹果树主要病害内生拮抗真菌的筛选及拮抗特性

【目的】筛选苹果树腐烂病菌Valsa malimiyabe与苹果树炭疽病菌Glomeralla cingalata的内生拮抗真菌,并研究其抑菌效果。【方法】分离发病地区健康苹果树的根、茎及其根际土壤中的拮抗内生真菌,室内抑菌试验测定其对苹果树腐烂病菌和苹果树炭疽病菌的抑制作用;发酵培养试验检测其内生真菌中抑菌物质的耐热性。【结果】分离到的18株内生真菌分属3个属,其中茎分离到的内生真菌的种类和数量较多;对峙试验表明,对苹果树腐烂病菌和炭疽病菌的抑菌率高于60%的有8株,其中菌株J2、J16、J17对苹果树腐烂病的抑制率分别为82.75%、84.31%和82.35%,菌株T1对苹果树菌株炭疽病的抑制率为80.67%。拮抗真菌J2、J16、J17、J24、T1发酵液对2种病原菌分生孢子萌发的抑制率均不小于39.55%,最高达69.75%;在121℃时,J11和T1无菌滤液的热稳定性较好,而J2无菌滤液在100°C时就失去了生物活性。【结论】拮抗真菌J2、J11、J16、J17、T1均对苹果树腐烂病菌及苹果树炭疽病菌有较强拮抗作用,可为开展这2种病害的生物防治研究提供潜在资源。     

利用巢式PCR检测花生青枯病菌

为建立花生青枯病菌的快速检测技术,本研究利用细菌16S-23SrDNA内源转录间隔区(ITS)通用引物L1/L2扩增花生青枯病菌基因组DNA并对其扩增序列进行克隆测序,通过与其同属近缘种做比较,设计1对特异性引物W1/W2,利用该对引物与细菌通用引物L1/L2建立了花生青枯病菌的巢式PCR检测方法。结果显示,引物W1/W2只能从花生青枯病菌中扩增出374bp的特异片段;巢式PCR检测灵敏度可达10fg·μL-1基因组DNA,较常规PCR提高1000倍;该技术可用于花生青枯感病期或者发病潜伏期时的病害检测。     

几种中药内生细菌对梨黑斑病菌的抑制作用研究

本研究针对从益母草、知母2种中药分离出的20株内生菌,采用平板对峙法对梨黑斑病菌进行拮抗作用研究,试验结果显示：益母草叶6、益母草叶2、益母草叶4、益母草叶1、知母根6和益母草叶8等6种内生菌对梨黑斑病菌有较显著抑制作用,抑制率分别达到92.55%、 90.98%、 88.63%、 83.92%、80.78%和80.00%。将这6株内生菌做进一步研究,配制成OD值为0.600的菌悬液,采用滤纸片法进行抑菌作用测定,发现益母草叶4抑制效果最好,平均抑菌率达到60.39%。益母草叶4与其他几种内生细菌之间差异显著。     

内生细菌EDR2的鉴定及其对油菜菌核病的防治

【目的】明确内生细菌EDR2菌株的分类地位以及对油菜菌核病的防治作用,为该菌株的进一步应用奠定基础。【方法】采用皿内和温室盆栽试验,测定菌株EDR2对油菜菌核病菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用以及对病害的防治效果;并结合菌体形态观察、生理生化特性测定以及16SrDNA序列分析确定该菌株的分类地位。【结果】内生细菌EDR2菌株能够有效抑制油菜菌核病菌的菌丝生长,并可导致菌丝出现畸形、细胞质外渗,同时其还对病菌的菌核萌发具有较强的抑制作用,培养原液的抑制率可达到96.6%。温室盆栽试验结果表明,菌株EDR2的培养原液和无菌培养滤液对苗期油菜菌核病均有良好的防治效果,其防效都在80%以上;菌株EDR2的喷施时间可影响其防治效果,其中以接种病菌前1d喷施防治效果最好,可达到95.4%;培养原液及不同倍数稀释液对病害的防治效果明显不同,随着稀释度的增加,其生防效果降低。菌株EDR2对供试的16种植物病原菌的菌丝生长均表现出一定的抑制作用,表现出较广的抑菌谱。结合形态和培养特征、生理生化特性及分子生物学鉴定结果认为,内生细菌EDR2属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。【结论】综合皿内及温室盆栽试验结果认为,内生枯草芽孢杆菌EDR2是1株对油菜菌核病具有较好防治潜力和开发前景的生防菌株。     

烟草黑胫病菌拮抗内生细菌的筛选

采用稀释分离法从黔南州采集的健康烟草组织中分离获得烟草内生细菌153株,通过平板对峙试验,从中筛选出2株对烟草黑胫病菌具有明显抑制作用的菌株LPN07和LPN09,其对黑胫病菌菌丝生长的抑制率分别为68.99%和65.97%。经16S rDNA序列分析,菌株LPN07和LPN09被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)细菌。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR 检测方法的建立与应用

【目的】由大斑突脐蠕孢（Exserohilum turcicum）和玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolaris maydis）引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌（登录号MAT1-1：GU997138和MAT1-2：GU997137）和小斑病菌（登录号MAT1-1：X68399和MAT1-2：X68398）交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp（大病斑菌）与490、136 bp（小病斑菌）的特异性目的条带。25 μL多重PCR扩增体系：2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃（大病斑菌）和55.0℃（小斑病菌）,35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。     

花生褐斑病菌和网斑病菌混合侵染对侵染概率和潜育期的影响

目的】花生褐斑病和网斑病是花生生产上主要病害,两种病害田间混发现象普遍,造成了严重的产量损失。论文旨在研究花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola）和网斑病菌（Phoma arachidicola）混合侵染过程中,不同因子对侵染概率和潜育期的影响,探讨病害间的相互关系,为制定多病虫害综合治理体系方案提供理论依据。【方法】在不同生育期、接种浓度和叶面保湿时间处理下,对白沙1016混合接种褐斑病菌和网斑病菌,分析不同因子对花生褐斑病菌和网斑病菌侵染概率的影响,探索病菌混合侵染与其侵染概率和潜育期的关系。【结果】单独接种2种病菌,其侵染概率均随花生生育期的延长而增加,即始花期＜盛花期＜开花末期。在同一生育期接种,随着保湿时间延长,接菌量增加,侵染概率逐渐增大。2种病菌混合接种其侵染概率有显著差异,混合接种较单独接种侵染概率均相应降低,并随着接种量的增加、生育期和保湿时间的延长,混合侵染概率较单一接种下降明显。不同生育期单一病菌接种,2种病菌的潜育期存在差异,在始花期和开花末期,褐斑病潜育期均为20 d,而在盛花期为16 d;网斑病在始花期潜育期较长为10 d,而在盛花期和开花末期均为7 d。潜育期的长短可能受叶片龄期和衰老程度的影响,病害潜育期在生育前期较长,后期相对较短,而受冠层温湿度的影响不大。混合侵染在一定程度上延长了病菌的潜育期。在始花期,混合接种褐斑病菌和网斑病菌的潜育期分别较单独接种长2 d和5 d;而在盛花期和开花末期,混合接种褐斑病菌潜育期比单独接种分别延长了4 d和2 d,网斑病潜育期没有发生明显改变,均为7 d。【结论】单独接种花生褐斑病菌和网斑病菌,侵染概率均随着生育期和保湿时间的延长和接种菌量的增加而增大,混合接种与单一接种相比,混合病菌侵染其侵染概率均较单独侵染有所降低,潜育期延长。花生褐斑病和网斑病潜育期的长短除受病菌与寄主互作影响外,可能受叶片龄期和衰老程度影响,而与冠层温湿度关系不大。     

不同碳源·氮源对花生网斑病生长的影响

[目的]探讨不同碳源、氮源对花生网斑病（Phoma arachidicola Marasas Pauer ＆ Boerema）菌丝生长的影响。[方法]以花生网斑病病菌菌种为供试材料,比较了在不同碳源、氮源培养基处理下花生网斑病菌丝的生长速率。[结果]适宜菌落生长的最适碳源为果糖、山梨醇,其次为可溶性淀粉、木糖;适宜菌落生长的最适氮源为硝酸钙,其次为硝酸钾、甘氨酸。[结论]该研究可为研究花生网斑病的发生机理提供理论基础。     

利用几丁质酶活性鉴定花生对网斑病和黄曲霉抗性的研究

通过室内接菌鉴定不同花生品种(系)对网斑病和黄曲霉菌的抗感性水平,同时测定花生组织几丁质内切酶、外切酶、总酶活性,验证了酶活与花生抗感病间的相关性。结果表明:几丁质外切酶活性在诱导前后与花生黄曲霉感病指数间的相关性均较高,分别达到0.9285、0.9284,可作为鉴定花生品种抗感黄曲霉的指标;几丁质总酶活经诱导后与花生网斑病的感病指数相关性高,达到0.959,可作为鉴定花生品种抗网斑病的指标。     

木霉菌Td系列菌株代谢产物的室内抑菌谱研究

利用摇床液体发酵、氯仿萃取木霉菌的代谢产物,采用菌丝生长速度法测定了3个木霉菌菌株的发酵代谢产物对禾谷类镰刀病菌、番茄枯萎病菌、苹果轮纹病菌、立枯丝核菌、苹果炭疽病菌、玉米弯胞病菌和花生网斑病菌的抑菌作用。结果表明,3个木霉菌株代谢产物对7种病原真菌均具有抑制作用,且抑菌作用强度和抑菌谱存在一定的菌株特异性。木霉菌株Td10的代谢产物对禾谷类镰刀病菌和立枯丝核菌抑制作用最强,Td31的代谢产物对苹果轮纹病菌和苹果炭疽病菌抑制作用最强,而Td100的代谢产物对禾谷类镰刀病菌和立枯丝核菌抑制作用较强;3个木霉菌株的代谢产物对花生网斑病菌抑制作用均较弱。     

Characteristic analysis of tetra-resistant genetically modified rice

In this study, the characteristic of three transformants named as B1 C106-1, B1 C106-2, and B1 C106-3 were studied that carried three innate resistant genes Bph14, Bph15, and Xa23, and two enthetic resistant genes Cry1 Ca# and Bar. The five resistant genes were all verified by PCR and the two enthetic genes were identified in single copy insertion by Southern blot. At tillering stage, the Cry1 C and PAT(phosphinothricin acetyl transferase) protein contents in leaf, sheath, and stem of T2 generation were in the similar pattern: leafstemsheath, and showed significant difference(P0.01) among three organs. The average contents of Cry1 C protein in plant of B1 C106-1, B1 C106-2, and B1 C106-3 were 12.95, 6.57, and 11.30 μg g–1, respectively, and showed significant difference(P0.01) among them. However, the average contents of PAT in plant of B1 C106-1, B1 C106-2, and B1 C106-3 were 28.54, 27.66, and 28.02 μg g–1, respectively, and there were no significant difference among three transformants. The glufosinate tolerable concentration of three transformants of T3 generation reached at least 6 g L–1, and the mortality of rice leaf rollers were above 97.4% in 5 days after being fed with fresh transformants' leaves. The Cry1 C protein toxicity was also assessed by silkworms, and the mortality of silkworms feeding mulberry leaves smeared with Cry1 C protein extracts of leaves of B1 C106-1, B1 C106-2, and B1 C106-3 were 90, 67.8, and 87.8%, respectively, that were positive correlation(r=0.993) with Cry1 C protein contents in plant of three transformants. The three transformants also maintained high resistance to brown planthopper and bacterial blight as the original version. The above results indicate the tetra-resistant rice germplasm was well-developed by pyramiding innate and enthetic resistant genes in an elite line to provide with resistances of glufosinate, rice leaf roller, brown planthopper, and bacterial blight.     

具有C_2-对称的新型手性双-S-2-(咪唑-1-基)脂肪酰二胺的合成

以L-氨基酸为手性源,合成了多种具有C2-对称的手性双-S-2-(咪唑-1-基)脂肪酰二胺并且进行了结构表征。在碱性条件下,L-氨基酸和乙二醛、甲醛经过缩合反应生成了(S)-2-(咪唑-1-基)羧酸钠,与甲醇作用转化为甲酯后继与二胺进行胺解反应制得目标分子。这些化合物可进一步合成新型手性咪唑鎓环蕃或进行配位络合、分子识别等研究。     

玉米轴色突变体698-3R的遗传鉴定

以辐射诱变获得的玉米红轴突变体698-3R为材料,通过遗传交配设计分析轴色的遗传规律,利用SSR-BSA法初步定位轴色基因,并对候选基因进行克隆和表达分析。结果表明:(1)突变体698-3R的红轴对白轴性状表现为显性遗传,受一对核基因控制,初步定位在第一染色体上的SSR标记phi095与umc1452之间,与phi095相距3.9cM,与umc1452相距7.1cM,将该基因暂定名为C(t);(2)以轴色基因 P1的cDNA为模板克隆C(t),发现698-3R有3个C(t)转录本,而野生型698-3中至少有2个;预测氨基酸序列比对发现,698-3R中3个C(t)蛋白的氨基酸序列与已知P_1-wr蛋白一致,突变使其获得完整的MYB结构域和酸性激活域,而野生型698-3中698-3-P-1蛋白由于编码序列缺失导致移码突变,不具有该功能结构域;(3)对C(t)基因qRT-PCR分析发现,除25DAP外,其余4个时期在698-3R中表达水平均显著或极显著高于698-3;以 A1和 C2基因表达验证分析发现,C(t)与验证基因表达模式一致,说明C(t)可能具有 P1激活调控 A1和 C2基因表达的功能。推测该红轴基因C(t)可能为一个 P_1-wr基因。     

氮沉降对杉木人工林土壤有机碳和全氮的影响

通过野外模拟试验,研究氮沉降增加对杉木人工林土壤有机碳、全氮及C/N比的影响。试验设计为4种处理,分别为N0(0 kg.hm-2.a-1)、N1(60 kg.hm-2.a-1)、N2(120 kg.hm-2.a-1)、N3(240 kg.hm-2.a-1),每处理重复3次。以尿素[CO(NH2)2]作为氮源,每月以溶液方式对林地进行喷施。通过2 a的处理后发现,随着氮沉降水平的增加,土壤有机碳呈下降趋势,而全氮含量则不断上升,致使土壤C/N比降低。