中国孢囊线虫新记录种——野生豆孢囊线虫记述及其对豆科植物的寄生性测定

【目的】在江西婺源县孢囊线虫调查中,从大豆根及根际土壤中采集到一个孢囊线虫群体,其形态特征和分子特征与大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)存在较大差异,因此对其形态学和分子特征以及寄生性等进行详细研究,以明确其种类及对豆科作物寄生性,为病害防控提供科学依据。【方法】从婺源县采集的大豆根及根际土样,用筛淘法分离孢囊,大豆根系上的孢囊用直接解剖法获取。用浅盘法分离根际土样中的2龄幼虫和雄虫。选取具典型特征的饱满孢囊制作阴门锥切片,浅盘法分离的2龄幼虫和雄虫制作永久玻片,在显微镜下观察记录孢囊、2龄幼虫和雄虫的形态特征,并进行形态特征测量。采用两对植物线虫通用引物AB28和TW81以及D2A和D3B分别扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和28S大亚基D2-D3区段,经序列测定,用MEGA软件采用邻接法(neighbor-joining(NJ)method)构建该线虫群体与孢囊线虫属其他种群的ITS和LUS D2-D3系统进化树,分析其系统发育关系。在温室内采用盆栽人工接种的方法,测定江西孢囊线虫群体对11种豆科作物的寄生性,同时测定国内40个大豆栽培品种对该孢囊线虫的抗病性。【结果】形态学观察和特征值测量结果表明,从江西婺源大豆上采集的孢囊线虫群体,其孢囊形态、2龄幼虫以及雄虫的形态特征与野生豆孢囊线虫(Heterodera sojae)的形态特征基本一致;ITS序列(MG859982)比对发现其与野生豆孢囊线虫ITS序列(KU160510和KU160512)的同源性为99%和98%,而与大豆孢囊线虫ITS的同源性仅为81%(KY794762.1)。D2-D3序列(MG859981)与野生豆孢囊线虫(KU160511)相似度最高,为99%。序列系统进化树分析发现以ITS序列与D2-D3序列构建系统发育树的结果相一致,江西孢囊线虫群体与野生豆孢囊线虫分布在同一支,节点支持率为100%,而与大豆孢囊线虫聚在另一个分支中。结合形态学和分子生物学结果,将江西婺源大豆上的孢囊线虫群体鉴定为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种。寄生性研究结果表明,在参鉴的11种豆科作物中,野生豆孢囊线虫的2龄幼虫能在大豆和相思豆(红豆)上侵染和繁殖,完成生活史;虽然能侵染豇豆、豌豆、扁豆、绿豆、赤豆、刀豆、菜豆和苜蓿8种作物根系,但不能完成生活史。测定的40个大豆栽培品种中,19个高感、11个中感、5个中抗、5个高抗。【结论】在我国江西婺源新发现的一种寄生于大豆的孢囊线虫为野生豆孢囊线虫,系中国新记录种;人工接种条件下相思豆(红豆)也是野生豆孢囊线虫的寄主,40个大豆栽培品种中30个对该孢囊线虫表现感病。     

日本罗汉松根际土壤中截获马里兰根结线虫

浙江宁波口岸从日本进境的罗汉松苗木根际土壤中分离出一种根结线虫属2龄幼虫,热杀死后虫体直,头部和尾部渐变细,但尾部变细更明显;体长351.7～418.4μm,体宽12.8～14.7μm;头部不缢缩,无唇环。口针长11.5～13.4μm,基部球圆形、小;侧区明显,有4条侧线;排泄孔位于半月体前3～4个体环处;尾长49.5～54.0μm,尾端钝圆,尾部透明区长9.5～13.5μm。通过PCR扩增了线虫28S rDNA D2-D3区、ITS和COI基因的分子标记,其在NCBI数据库的登录号分别为ON176683、ON171447、ON171452,并将其与下载的近似种序列进行了系统发育分析。综合2龄幼虫形态特征和系统发育树分析结果,判定所分离的线虫为马里兰根结线虫(Meloidogyne marylandi)。这是我国口岸首次截获该种线虫。     

朝鲜孢囊线虫——浙江省孢囊线虫新记录种

在2015—2016年间对浙江省孢囊线虫的种类及分布进行了调查,从浙江省临安市雷竹根围采集到一个孢囊线虫群体,采用形态学和分子生物学方法对其进行了鉴定。利用光学显微镜和扫描电子显微镜对孢囊和2龄幼虫(J2)的形态进行系统的观察和测量,主要形态特征为:孢囊近圆形,有明显的短颈和阴门锥,无下桥、泡囊突和膜孔,阴门裂长45.3μm;2龄幼虫体长528.5μm,头部缢缩不明显,具2个唇环数,口针长19.6μm;侧区具3条侧线;尾圆锥形,末端尖细,尾长75.4μm,透明尾占尾长的55%~75%。对该线虫群体rDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和28SD2D3区进行特异性扩增,分别得到1 006bp和786bp的片段,与朝鲜孢囊线虫(Heterodera koreana)的序列相似度分别高达99.7%和99.6%;综合形态学、分子鉴定及系统进化分析等,将分离自雷竹的孢囊线虫群体鉴定为朝鲜孢囊线虫,系浙江省孢囊线虫的新记录种。     

长针线虫Longidorus pinus的形态和分子鉴定

在传统形态学分类鉴定的基础上,结合18S和28S核糖体(r DNA)序列分析方法,对采自山西介休市枣树根际土样中的线虫进行了种类鉴定。结果表明,雌虫热杀死后呈J型或C型,体长3 480～4 366μm,唇区明显缢缩,齿尖针70～82μm,导环距头前端31～34μm,阴门位于体中部,尾短,圆锥形;雄虫未发现;1龄幼虫的替代口针插入齿托内部,尾短,圆锥形,齿尖针44μm,替代口针长度52μm。其鉴定代码为A23-B1-C23-D4-E1-F2-G23-H23-I1-J2-K6。系统发育研究表明,试验种群的18S和28S区序列与Longidorus pinus相应序列(18S:MF674014～MF674015;28S:MF674016～MF674019)在同一进化枝上,置信度分别达100%和96%。通过形态和分子特征,将该种群鉴定为Longidorus pinus Xu,Ye,Wang&Zhao,2018。Longidorus pinus在枣树上首次报道,枣树为该线虫的新寄主。     

寄生柑橘和杉木的柑橘半穿刺线虫种内群体变异

[目的]对寄生于柑橘与杉木2种寄主的柑橘半穿刺线虫种群的rDNA-ITS区(ITS1-5.8S-ITS2)及形态变异进行研究,分析种群间遗传多态性及其亲缘关系.[方法]对采自中国3个省份(福建、四川、贵州)柑橘产区的21个柑橘半穿刺线虫种群(柑橘种群)及福建省杉木林区的6个柑橘半穿刺线虫种群(杉木种群)的ITS区进行PCR扩增、克隆与测序,通过相关软件进行序列比对与系统发育分析;对3个柑橘种群及1个杉木种群进行形态特征测计分析.[结果]柑橘半穿刺线虫的柑橘种群与杉木种群相比,ITSI序列相似性为93.2%-99.3%,ITS2序列相似性为92.4%-100%;基于ITS序列构建的系统发育树,所有杉木种群与福建省部分柑橘种群处于同一进化主分枝.4个柑橘半穿刺线虫种群间部分测量值存在显著差异,补充描述了种群内二龄幼虫尾部形态变异类型.[结论]柑橘半穿刺线虫柑橘种群和杉木种群在rDNA-ITS序列相似性高,序列差异不能用于种群的区分;杉木种群与福建部分柑橘种群在进化上可能有相同的地理起源.种群间部分测量值的显著差异及二龄幼虫尾部变异应属于种群正常变异.     

榆中县黄瓜根结线虫鉴定及根系定殖效果测定

为了明确甘肃榆中县温室大棚黄瓜根结线虫种类及根际定殖情况,采用形态和分子生物学鉴定其种类,并室内测定和显微观察其在根际定殖效果。结果表明,甘肃榆中县黄瓜根结线虫不同虫态形态、大小和雌虫会阴花纹特征等均具有典型南方根结线虫(Meloidogyne incognita)形态特征。基于线粒体COI基因序列比对和构建系统发育树,鉴定发现榆中县黄瓜根结线虫线粒体COI基因序列与已报道的南方根结线虫台湾株系(KU517167)聚为一类,其相似性为99.75%;根结线虫多序列特异位点鉴定发现其与南方根结线虫孟加拉国株系(MN196556)和南方根结线虫印度株系(MN728697)聚为一类,相似性分别为100%和96.91%。经致病性测定发现,待接种根结线虫2龄幼虫30 d后其能够侵染黄瓜根系并形成大量根结,经染色发现黄瓜幼苗根系组织内寄生大量线形蠕虫、雌虫和卵囊,且镜检观察发现其形态与田间采集后分离的线虫形态一致。综上可知,引起甘肃省榆中县黄瓜根结线虫病的病原为南方根结线虫。     

大豆孢囊线虫扩展蛋白新基因(Hg-exp-1、Hg-exp-2)的鉴定及功能分析

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。     

安徽省宿州市小麦孢囊线虫病发生动态调查

[目的]研究安徽省宿州市小麦孢囊线虫发生规律。[方法]2015—2018年,通过定点采集小麦田土壤和小麦样本,监测土壤中小麦孢囊线虫的孢囊数量、卵量、2龄幼虫数量以及小麦根系内部孢囊线虫的发育情况,鉴定田间小麦孢囊线虫群体类型。[结果]安徽省宿州市试验田内小麦孢囊线虫群体为禾谷孢囊线虫和菲利普线虫的混合种群,其中以禾谷孢囊线虫为主;其孵化和侵染高峰期为2月下旬至3月上旬,3至4龄幼虫发育高峰期为4月上旬,5月上旬根部可见白雌虫。[结论]明确了安徽省宿州市小麦孢囊线虫的种类和发生动态,为其有效防治奠定了基础。     

腐烂茎线虫不同地理种群ITS区序列比对及系统发育

为弄清我国腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)不同地理种群ITS(Internal transcribed spacer)区之间的碱基差异及系统发育关系,本研究通过网络软件Clustalw1.83对腐烂茎线虫的核糖体ITS区核酸序列进行了比对,结果发现腐烂茎线虫的8个种群中,DEll、DEly、DEAY987007三个种群(I组)内部之间的碱基差异在1%以内,其它的5个种群(II组)之间的差异为0～1%,而I组与II组种群之间的差异达到了15%(根据ITS1+5.8s+ITS2序列)或20%(根据ITS1+ITS2序列)。这说明我国腐烂茎线虫很可能是1个复合种。根据ITS区核酸序列构建的系统发育图同样显示,我国腐烂茎线虫的7个地理种群明显分为2个分支A和B。     

小麦孢囊线虫江苏群体的形态学与分子特征鉴定

【目的】明确小麦禾谷类作物孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）江苏群体的种类组成及群体间遗传变异情况,为抗病品种的选育、利用以及病害综合防治提供依据。【方法】对江苏省的13个代表性CCN群体进行孢囊、阴门锥和2龄幼虫的形态观察和形态测计并与相似种进行比较;PCR扩增上述群体的rDNA-ITS区并克隆测序,构建基于ITS序列的系统发育进化树。【结果】通过形态观察和形态测计值的比较,所测定的江苏群体均与已报道的禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）中国群体的测计值相接近;系统进化关系分析显示CCN江苏群体、国内其它地区以及国外禾谷孢囊线虫群体均处于同一大的进化分子簇,且国内和国外群体分别处于不同的进化分支。【结论】所测定的13个江苏省CCN代表性群体均为禾谷孢囊线虫,各群体间形态及ITS序列变异较小,江苏省目前尚未发现菲利普孢囊线虫（H. filipjevi）。