拟南芥AtEXP1基因启动子的克隆及转录调控元件分析

为了研究拟南芥扩张蛋白AtEXPA1基因启动子上与转录调控有关的元件,我们通过PCR技术克隆了AtEXPA1基因上游897bp具有启动子活性的序列,再将启动子作不同程度截短,所有片段与GUS基因融合,构建植物表达载体,采用基因枪轰击拟南芥叶片和PEG介导转化烟草原生质体,通过定性和定量检测GUS的活性,发现在靠近翻译起始密码子的上游144bp之间存在增强转录活性的元件。将PEG介导转化的烟草原生质体,分别进行光诱导,冷诱导, 脱落酸（ABA）,盐处理,根据GUS定量检测的结果,推测（1）在AtEXPA1基因启动子上广泛存在与光调控有关的元件,（2） -897～-626 bp之间存在冷负调控元件, （3）-626～-444 bp之间存在与ABA负调控有关的元件,（4）-626～-282 bp之间存在与盐负调控有关的元件。     

巴西橡胶树HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5＇调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

花生ARAhPR10基因启动子序列的克隆及分析

PR10（pathogenesis-related class10protein）类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性（SAR）有着紧密联系,本文采用基于PCR的基因组DNA步移法,从抗黄曲霉花生品种粤油20中克隆ARAhPR10（Aspergillus flavus-resistant AhPR10）基因起始密码子ATG上游256bp类似启动子序列,并对其进行植物顺式作用元件数据库PLACE预测分析。结果表明,该类似启动子序列含有4处TATA box和2处CAAT box保守的启动子结构元件,还有6处W-box、1处BIHD1和3处GT-1motif抗逆应答元件,其中W-box常见于PR蛋白的启动子区内参与病程应答。我们初步认为本研究克隆的序列可能是ARAhPR10基因的启动子。     

构建脱水反应元件(DRE)报告子用于小叶杨DRE转录因子的克隆

通过基因合成构建了脱水反应元件(dehydration-responsive element,DRE)酵母表达载体,通过同源重组,利用SD-His-Ura平皿筛选获得了含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE双重报告子的酵母即得DRE报告子。建立小叶杨(Populus simonii)干旱模型,提取RNA,构建小叶杨cDNA AD融合表达文库,通过酵母单杂交的方法,用DRE报告子对小叶杨cDNAAD融合表达文库进行了筛选,得到了2个阳性克隆。结果表明,所构建的DER报告子被激活,可用于小叶杨DER转录因子的克隆。     

水稻种子贮存醇溶蛋白4a基因的启动子I及其调控元件

水稻种子贮存醇溶蛋白４ａ基因５‘端上游区由两个启动子组成。将启动子Ｉ与报告基因ＧＵＳ融合,在根癌农杆菌介导下,转化烟草,经组织化学分析,确定启动子Ｉ为种子特异性动子。启动子Ｉ的５’端系列缺失分析证明,－２１２－１６７区段是启动子Ｉ种子特异性关键调控元件。     

桃PGIP基因及其启动子的克隆与分析

桃流胶病是一种严重危害桃树的真菌性病害,为研究PGIP基因在桃抗流胶病及抗其它真菌性病害中的作用,本研究以桃抗流胶病品种‘南京白沙’叶片为材料,对其PGIP基因及启动子序列进行克隆与分析。克隆测序获得了‘南京白沙’桃PGIP基因cDNA序列（GenBank登录号：HQ453972）和PGIP基因组DNA序列以及起始密码子上游453bp的启动子序列（GenBank登录号：HQ453974）,并将该PGIP基因命名为PpPGIP2。‘南京白沙’桃PpPGIP2序列分析显示,该DNA序列具有完整的阅读框,无内含子,与GenBank中登录的李属PGIP基因序列同源性在93%～98%之间,与测序完成的桃全基因组中该基因的序列同源性为96%;PpPGIP2编码的氨基酸序列分析显示,该氨基酸序列含有2个典型的亮氨酸重复序列,信号肽为第1～第24个氨基酸残基;PGIP基因的序列聚类图显示,除了科、属、种间的同源性差异外,桃的种内PGIP基因同源性也有较大差异;PpPGIP2启动子序列分析发现3个抗病相关元件,分别为：GT1CONSENSUS、SEBFCONSSTPR10A和WBOXATNPR1,另外还有与激素调控、胁迫有关的调控元件。本研究对‘南京白沙’桃PGIP基因和启动子的克隆与分析,将为进一步研究桃PGIP基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

构建脱水反应元件（DRE）报告子以用于小叶杨DRE转录因子的克隆

许多诱导型基因的表达均受特定的转录因子和顺式元件调控，脱水反应元件（Dehydration-Responsive Element，DRE）对植物的抗旱和抗低温基因的表达调控具有重要作用。拟南芥等草本植物的特异性结合DRE转录因子已有所研究，但木本植物中能够特异性识别DRE的转录因子尚未见报道。酵母单杂交技术是发现序列特异性DRE结合转录因子的一种很有效的方法。而获得含有DRE顺式元件的报告酵母菌株是应用酵母单杂交技术研究树木来源的DRE结合转录因子的前提。本文通过基因合成构建含有DRE顺式元件的报告酵母菌株，初步研究表明该报告酵母菌株可以用于研究与寻找木本植物DRE结合转录因子，为通过基因工程手段改善树木抗逆性研究奠定了科学基础。     

Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建

隶属于MADS-Box基因家族的拟南芥花器官B类特征基因APETALA3（AP3）在花瓣和雄蕊中特异性地表达;AP3基因编码转录因子,与A类和C类特征基因协同作用控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育。研究表明AP3基因启动子为花特异表达启动子。因此,AP3基因启动子的克隆及功能鉴定对于园林植物与花相关的商业性状的定向改良具有重要作用。本文根据GenBank数据库报道的Ler生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）AP3基因启动子序列（U30729）设计了一对特异性扩增引物,基于PCR技术,用高保真的KOD-plusDNA聚合酶扩增了长度为1767bp的Col生态型拟南芥AP3基因启动子,并命名为pAtAP3,其Gen-Bank登录号为FJ619533。Bl2seq在线分析表明pAtAP3与U30729序列的相似性达98%,与Col生态型拟南芥BAC克隆T12E18（AL132971）9264~11030之间的碱基序列相似性达100%,且该段序列的下游基因编码AP3蛋白（CAB81799）,说明克隆序列为Col生态型拟南芥AP3基因的启动子。PLACE在线分析表明pAtAP3具有基本的启动子元件TATA-box和CAAT-box,还包含大量与花特异表达相关的顺式元件CArG1、CArG2、CArG3和anther-box等。本试验进一步构建了植物表达载体pAtAP3：：GUS,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

中棉光诱导基因Gacab 启动子的克隆及其功能分析

利用加接头法，从金华中棉(Gossypium arboreum)中分离获得了捕光叶绿素a／b蛋白复合体基因Gacab编码区5′上游的调控序列1009bp，命名为Gacab P，与公布的其它植物cab启动子序列比较，没有明显的同源性。将GacabP和197、504、779bp的5′端缺失体分别与gus(uid A)基因融合，构建植物表达载体。用Gacab P：：gus转化烟草(Nicotiana tabacum cv．NC89)，GUS组织化学分析发现Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达。在暗培养的转基因烟草叶片中Gacab P不表现活性，而光能够诱导gus基因的表达，表明Gacab P是一种光诱导型启动子。用基因枪轰击水稻愈伤组织，结果显示，Gacab P及3种不同长度的缺失体均可驱动gus基因的瞬时表达，以504bp的活性最高，瞬时表达水平明显高于35S启动子，197、779和1009bp的表达减弱，由此推测-197～-1bp为Gacab基因的基本启动子，-504～-197bp间包含正调控元件，-1009～-504bp间包含负调控元件。     

水稻HTD1基因启动子在转基因拟南芥中的表达特征

通过分析β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, GUS）基因产物,对水稻HIGH-TILLERING DWARF1(HTD1)基因启动子在转基因拟南芥中的表达特性进行初步研究。用已构建的含HTD1基因启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,观察该启动子的表达特性。结果表明,在HTD1基因启动子的驱动下,GUS报告基因主要在转基因拟南芥幼苗期的叶片、叶柄、下胚轴以及主根基部的维管组织中表达。     

马立克氏病病毒CVI988株病毒囊膜糖蛋白B启动子的克隆及活性分析

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病毒对载体的重组病毒的免疫保护力,克隆了马立克氏病病毒(MDV)CVI988株病毒囊膜糖蛋白B(gB)启动子,通过测序分析发现克隆的gB启动子与GenBank上发表的MDVGA株序列的同源性为99.5%。分别以β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)和虫荧光素酶(luciferase)为报告基因,构建pSK-gB-LacZ和pgB-Luc真核表达载体。将pSK-gB-LacZ转染的中国地鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞进行染色,出现蓝色,说明在CHO细胞中,MDVgB启动子可以有效地调控lacZ基因的转录。在CEF细胞中,利用虫荧光素酶系统将gB启动子与SV40及hCMV启动子进行活性比较,发现hCMV启动子的活性为gB启动子的31倍,SV40启动子为gB启动子的27倍。     

花特异表达启动子PchsA的克隆及其序列分析

根据Ingrid M报道的矮牵牛花特异表达基因CHS A启动子的序列设计并合成一对特异引物，以矮牵牛（Petunia hybrida）叶片总DNA为模板，通过PCR扩增获得约含0.5kb大小的DNA片段，回收该片段并克隆到pGEM^R-T Easy载体上，进行测序，该片段含514bp。采用pcgene软件进行启动子序列结构的分析，第401－407之间有一个TATA box，第52－62位碱基间有一个CCAAT box，第429－434之间有一戴帽位点（cap site)，第21－36个碱基间有一个anther blox，第303－320位碱基间有一个box2元件，第335－349位碱基间有一个box1元件，box1元件内包含有一个G－box，第362－267之间还有一下G－box，第370－382之间有2个拷贝的TACPyAT box，所有这些调控元件及其附近的序列与报道的序列完全一致。但该序列在第78－248个碱基间比报道序列多出一段171bp的序列，经Splice site prediction分析，在第146－250bp之间为一内含子的序列（105bp)。     

水稻rbcs基因启动子的克隆及结构功能分析

利用PCR法克隆了水稻日本晴来源的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因（rbcS）5’上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶鞘、茎杆及颖壳中特异性表达，在胚乳中不表达。然后构建不同长度片断的Posrbcs的5’端缺失体，分别与gus构建融合基因，转入水稻中。对转基因植株GUS活性定量分析结果显示， Posrbcs片段愈短，GUS活性愈低；进一步的光诱导试验结果显示，光能明显提高gus基因表达活性，并且随着Posrbcs片段缩短，Posrbcs中的I box、GT1结合位点、GATA box、T box 等光诱导相关元件的缺失会造成在不同时间段的光诱导活性降低以及光诱导表达时间后移。凝胶阻滞试验证实Posrbcs序列中的这些光诱导相关元件有相应的核蛋白的结合。     

小鼠基因内含子中CpG岛和几个转录调控元件分析

内含子在基因转录调控中的作用已多次被实验报道,然而对其参与调控的普遍性还缺乏足够的理论支持。本研究利用计算分析方法,对小鼠基因内含子中的CpG岛（CpGisland）、TATA框（TATAbox）、CAAT框（CAATbox）以及GC框（GCbox）等元件的出现频率进行分析。结果发现,分别有56.01%、57.16%、65.88%和41.86%的第一内含子具有CpG岛、TATA框、CAAT框以及GC框,而它们在其它内含子中的平均出现频率则分别为14.07%、45.24%、49.91%和13.19%。即使考虑到不同位置的内含子,这些元件在第一内含子中的出现频率也显著高于它们在其它任何位置内含子中的出现频率。由于CpG岛、TATA框、CAAT框以及GC框均与基因的转录调控有关,据此推测小鼠第一内含子在基因转录调控过程中具有潜在的重要性。本研究结果为内含子参与转录调控提供了更多的理论依据。     

烟草NtMTPC4启动子的克隆与缺失分析

组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。     

水曲柳SnRK2B基因和启动子的克隆及分析

为了研究水曲柳中同源SnRK2转录因子的功能,在水曲柳干旱响应转录组中寻得SnRK2B的同源序列并克隆得到SnRK2B转录因子基因全长,将其命名为FmSnRK2B。使用SiteFinding-PCR法扩增获得SnRK2B启动子序列,并对FmSnRK2B基因编码区及其启动子进行生物信息学分析和启动子顺式调控元件分析。结果表明,克隆得到的全长序列包含完整的开放阅读框1074bp,编码357个氨基酸。启动子顺式作用元件分析结果表明,其启动子区包含脱落酸应答元件ABRE及胁迫相关元件HSE、MBS等。干旱胁迫下,FmSnRK2B基因的表达随胁迫时间的延长先增加后降低,表明其参与植株的抗逆过程。本研究对进一步揭示水曲柳的抗逆机制具有重要意义。     

奶牛硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(SCD)启动子的克隆及活性分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪酸合成过程中的一个主要限速酶,为了研究奶牛脂肪合成的基因调控机制,本研究首先从奶牛组织中克隆得到4个不同长度的SCD基因启动子片段(分别为212、380、416和760bp),采用生物信息学的方法分析了启动子上不同的转录因子结合位点,将克隆片段与pGL3-basic荧光素酶报告基因载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切,连接形成重组启动子载体pGL3-SCD1、pGL3-SCD2、pGL3-SCD3和pGL3-SCD4。将载体纯化后,瞬时转染到HepG2细胞,对细胞施加胰岛素(10IU/mL)和亚油酸(120μm)处理,通过双荧光素酶报告基因检测启动子荧光素酶相对活性,结果发现,在SCD启动子序列上存在Sterol-regulated element(SRE)转录因子的结合位点,随着SCD启动子片段长度的延长,启动子活性也显著提高,pGL3-SCD4具有最高的启动子活性。与对照组相比,pGL3-SCD1~4启动子的活性在胰岛素刺激下都显著增强(P<0.05),其中pGL3-SCD4的启动子的相对活性最高,达到了46.93。在亚油酸刺激下,pGL3-SCD1~3的启动子活性没有显著变化,而pGL3-SCD4的活性显著减弱(P<0.05),研究表明pGL3-SCD4启动子上增加的片段(-398~-742)可能对于SCD基因的表达调控具有重要作用。     

一个水稻根时空差异表达启动子的克隆及功能分析

本研究旨在分离克隆水稻根特异表达的启动子,为育种提供资源.本实验结合本室芯片数据库和RT-PCR验证得到一个水稻根特异表达的基因(TIGR Locus:Loc_Os05g19570),采用PCR技术从MH63的基因组DNA中扩增其上游启动子P12,长度为1950 bp,将该启动子片段与报告基因gus相连,构建植物表达载体,农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)介导转化水稻(Oryzative ssp.japonica)中花11.组织化学分析及荧光定量测定显示该启动子具有根特异性及时间差异性.根据P12启动子序列特征,利用PCR对其进行有目的的缺失,将5个长度不同的缺失片段分别与gus相连,构建植物表达载体,转化水稻中花11.荧光定量测定结果表明:-1059～-819bp区域缺失后,报告基因在根里的表达量显著降低,说明这个区域可能存在顺式元件.本研究成功的分离克隆到一个水稻根特异的启动子P12,进一步分析发现其还具有时间差异性.