MDV引起肉鸡动脉粥样硬化机理的研究

马立克氏病(MD)是由疱疹病毒引起的一种高度接触传染性淋巴组织增生性肿瘤疾病.近年来,许多学者在研究该病时发现感染马立克氏病病毒的鸡发生了冠状动脉粥样硬化(AS),引起国内外临床学界和微生物学界的高度关注.本试验通过人工接种MDV,建立肉仔鸡动脉粥样硬化(AS)的病理模型,从而研究MDV诱发AS的发生机理,为今后在人类医学上预防冠状动脉粥样硬化奠定基础.     

鸡马立克氏病毒疫苗的种类和应用

鸡马立克氏病毒（MDV）疫苗目前分为如下5类：血清Ⅰ型马立克氏病毒疫苗,血清Ⅱ型马立克氏病毒疫苗,血清Ⅲ型马立克氏病毒疫苗,马立克氏病毒多价苗,马立克氏病毒基因工程苗。马立克氏病毒疫苗的应用,应结合鸡马立克氏病（MD）的流行病学特点和马立克氏病毒疫苗的特性进行合理选择应用。     

马立克氏病毒强毒株攻击免疫鸡群的诊断

为准确诊断发病鸡群的发病情况.对检测样本进行流行病学和血清学调查、病理组织学观察以及基于马立克氏病毒1型(MDV-1)长独特区内部重复序列132bpr基因合成特异性引物,扩增MDV-1的该重复序列.结果表明:该免疫鸡群受到了MDV强毒攻击,发生了马立克氏病.     

马立克氏病肿瘤相关的表面抗原研究进展

马立克氏病肿瘤相关的表面抗原是MD肿瘤细胞和MD成淋巴细胞系细胞表面存在的特异性抗原,在此综述了马立克氏病肿瘤相关的表面抗原的细胞分布、分离纯化,理化特性等方面的研究进展,指出马立克氏病肿瘤相关的表面抗原在马立克氏病的肿瘤免疫和鉴别诊断中具有重要的意义。     

如何科学防治鸡马立克氏病

1鸡马立克氏病的分类 马立克氏病（MD）是鸡的一种常见和重要的肿瘤性疾病,由血清1型疱疹病毒（MDV）引起,根据其临床表现和病变发生的部位,可分四种类型：神经型、内脏型、眼型和皮肤型。     

浅析鸡马立克氏病免疫失败的原因

鸡马立克氏病(MDV)对养鸡业危害严重.70年代初研制出有效疫苗并广泛应用,发病率大大下降,然而,有一些养鸡(户)在接种了马立克氏病疫苗后,仍频频发生马立克氏病,造成这种免疫失败的原因,笔者认为有以下几个方面:     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白I原核表达产物单克隆抗体的制备

以重组质粒 p GEX-MDg I在大肠杆菌 BL2 1中表达马立克氏病病毒 (MDV)特超强毒 64 8A株的囊膜糖蛋白 I(g I)完整基因 ,通过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离相应的蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原免疫小鼠 ,用以制备针对MDV64 8A g I糖蛋白的杂交瘤细胞株。以 MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)为检测抗原 ,用间接免疫荧光抗体反应(IFA)筛选到 9株杂交瘤细胞株 ,选其中 3株 2 H7、6F1 0、2 H3制备腹水 ,其 IFA效价均达到 1∶ 1 50 0以上 ;与 I型 MDV不同致病型的毒株 CVI988/ Rispens、GA、RB1 B、Md1 1株感染的 CEF测 IFA,均呈现特异性荧光 ,但反应强度不同。腹水经 PBS稀释后与 MDV感染的 CEF做斑点酶联免疫吸附试验 ,呈特异性显色。对 MDV感染的 CEF裂解物做 West-ern-blotting,可检测出 1条特异性条带     

鸡马立克氏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR GreenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。     

马立克病病毒糖蛋白B抗原基因克隆的酶切分析

用狄可辛标记的马立克病病毒(MDV)基因组DNA的BamHⅠ-K_3片断为探针,从建于pUC18质粒中的GA株MDV感染细胞基因组DNA的基因文库中,筛选到MDV糖蛋白B抗原基因克隆,酶切分析表明,GA株MDV的B抗原基因克隆在EcoRⅠ、HindⅢ、SalⅠ及BamHⅠ等酶切位点的分布上与RBIB株MDV的B抗原基因没有区别。     

无致病性马立克氏病病毒和致弱马立克氏病病毒疫苗的传染性和免疫性

用MDV-19疫苗(无致病性马立克病病毒)、AM-1(致弱马立克氏病病毒)疫苗和NSW1/70(火鸡疱疹病毒)疫苗接种免疫具有不同免疫史的亲代的雏鸡,然后以马立克氏病强毒攻击,比较其反应和保护力。MDV—19疫苗免疫的有母源抗体     

亲和层析法提纯鸡马立克病毒gB基因重组产物

应用针对鸡马立克病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）抗原单克隆抗体ＩＡＮ８６制备亲和层析柱，从感染重组杆状病毒（ｇＢ－ＡｃＮＰＶ）的昆虫细胞中提纯鸡ＭＤＶｇＢ基因重组产物，获得较好效果。提纯的蛋白质在ＳＤＳ－ｐＡＧＥ中出现的５条条带中有４条在免疫印迹试验中出现，其分子量为１００，６０，４９，４０ｋｄ占蛋白总量的５４．７％。试验证明用单克隆抗体亲和层析法提纯ＭＤＶｇＢ基因重组产物是一个行之有效的方法。     

表达NDV F48E9株F基因的MDV CVI988株转移质粒载体的构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700bp克隆到真核表达载体pIRES中,构建成表达F基因的载体pIRESF,然后将包含F基因及其上游的内含子和下游的polyA的2900bpDNA片段再克隆入包含gB启动子的SK载体中,并使其克隆到gB启动子600bp的下游,最后将包含gB启动子和F基因表达盒3500bp克隆到包含MDVCVI988非必须片段US10的载体SK中。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的MDVCVI988重组病毒奠定了基础。     

鸡3种主要DNA病毒多重感染复合PCR检测方法的建立

依据Gen Bank中注册的鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、鸡痘病毒(FPV)基因组核苷酸序列中的保守序列设计引物,3种病毒各设计3对引物,共计9对引物,经生物学软件筛选后,得到3对相互匹配较佳的引物。3对匹配引物经单一PCR验证后,优化复合PCR反应条件,确定最佳的退火温度、引物浓度和Taq DNA聚合酶浓度;经特异性、敏感性试验及简化PCR试验,建立简易复合PCR检测方法。复合PCR扩增出的3条带大小与预期一致,即228 bp(MDV)、400 bp(ILTV)、499 bp(FPV);建立的复合PCR方法能同时检测出100 fg MDV、ILTV、FPV的DNA。同时依据PCR技术原理,将经典的三温热循环改进为二温热循环试验,即将退火和延伸合并为一步(62℃),缩短了反应时间。建立的3种病毒的复合PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床病料的快速诊断。     

马立克病病毒pp38基因的编码序列及译读框

马立克病病毒(MDV)与致肿瘤相关的38kd磷蛋白(pp38)基因的编码序列是一个不含有内含子的由870个碱基对组成的DNA片断。从对MDVpp38-λgtll Lac Z融合基因的定序及已知Lac Z基因的译读框,直接读出了MDVpp38基因的译读框。根据计算,由该译读框推导出的该基因编码的由290个氨基酸组成的初级多肽分子量约为31kd.     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

马立克氏病病毒p79抗原基因在大肠杆菌中的表达特性分析

马立克氏病病毒（ＭＤＶ）的７９ｋｄ蛋白质是该属３个血清型所共有的抗原．用能表达该蛋白质片段的重组噬菌体Ｌａｍｂｄａｇｔ１１克降ＧＢ－２在宿主菌大肠杆萌Ｙ１０９０菌株中表达该蛋白，免疫转印试验中的确产生了能为对７９ｋｄ蛋白质的单克隆抗体Ｔ８１所识别的表达产物。表达过程中，不论加入或不加蛋白分解酶抑制剂，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ中均未显示分子量大于β－半乳糠甘酶的融合蛋白的存在，而是产生了能为单克隆抗体Ｔ８１识别的分子量分别约为５０ｋｄ，３０ｋｄ，２６ｋｄ的３条多肽，用从凝胶中回收的这３条多肽混合物免疫的小鼠血清，在１：４稀释时，与ＭＤＶ感染的ＤＥＦ细胞在免疫荧光反应中呈阳性反应。此外，用抗β－半乳糖甘酶免疫亲和层析柱杜所得到的提纯蛋白质也不被单克隆抗体Ｔ８１所识别．用和不用ＩＰＴＧ诱导的对照试验表明，在该ＧＢ－２克隆中的ＭＤＶｐ７９基因的表达与Ｌａｍｂｄａｇｔ１１表达外源基因的通常方式不同，不需要ＰＴＧ诱导，而是呈现结构性表达的特征，暗示该蛋白质基因的表达并不使用β－半乳糖苷酶基因启动子。     

The Helper Activities of Different Avian Viruses for Propagation of Recombinant Avian Adeno-Associated Virus

To compare the helper activities of different avian viruses for propagation of recombinant avian adeno-associated virus （rAAAV）, AAV-293 cells were cotransfected with the AAAV vector pAITR-GFP containing green fluorescent protein （GFP） gene, the AAAV helper vector pcDNA-ARC expressing the rep and cap genes, and the adenovirus helper vector pHelper expressing Ad5 E2A, E4, and VA-RNA genes. Chicken embryonic fibroblast （CEF） or chicken embryonic liver （CEL） cells were cotransfected with the AAAV vector and the AAAV helper vector, followed by infection with Marek＇s disease virus （MDV）, avian adenovirus, chicken embryo lethal orphan （CELO） virus or infectious bursal disease virus （IBDV）. Infectious rAAAV particles generated by the two strategies were harvested and titrated on CEF and CEL cells. A significantly higher viral titer was obtained with the helper activity provided by the pHelper vector than by MDV or CELO virus. Further experiments showed that rAAAV-mediated green fluorescent protein （gfp） expression was overtly enhanced by MDV or CELO virus super infection or treatment with sodium butyric acid, but not by IBDV super infection. These data demonstrated that MDV and CELO viruses could provide weak helper activity for propagation of rAAAV, and rAAAV- mediated transgene expression could be enhanced by super infection with the helper viruses.     

DNA去甲基化对马立克氏病病毒(MDV)基因表达的影响

以鸡马立克氏病脾脏淋巴瘤继代细胞系MDCC-MBI(MSB1)为研究对象，用southern和northern斑点分子杂交放射自显影等方法，证明了5-氮胞苷可以阻断MSB1细胞DNA的甲基化，且去甲基化的DNA转录区和部分非转录区有特异增幅的转录产物mRNA，说明这些区基因转录活性上升。用5-氮胞苷处理MSB1细胞使其去甲基化后，该细胞DNA的内切酶Barn HⅠ区域对DNaseⅠ敏感性增高，该片段区的基因表达活性也增高。以上结果提示．DNA的去甲基化可以提高MDV的基因表达，进一步说明MDV DNA的甲基化在抑制MDV基因表达，维持MDV在淋巴瘤细胞株中潜伏感染状态可能起着重要作用。     

马立克氏病鸡MDV血清基因的克隆与鉴定

[目的]克隆马立克氏病鸡MDV血清基因,并对其进行鉴定。[方法]从潜伏期感染马立克氏病鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR扩增马立克氏病毒的L-meq基因。将其插入pMD18-T克隆载体并进行测序,并用DNAman软件进行序列分析。[结果]获得的DNA片段的序列与已发表的L-meq基因序列相一致,表明该试验成功获得了目的基因。[结论]该研究可为鸡马立克氏病的预防与治疗提供新思路和新方法。